Rab家族小G蛋白调控禾谷镰刀菌DON毒素合成与分泌的分子机制

Rab GTPases are important cellular regulatory proteins during membrane traffic in all eukaryotic cells, and play an important role in endocytic and exocytic pathways. Studies have shown that the synthesis and secretion of trichothecene mycotoxin deoxynivalenol (DON) occurs in the toxisomes and Tri12 vesicles in Fusarium graminearum. Our previous studies have shown that the production of the DON was significantly reduced in FgRAB5, FgRAB7 and FgRAB8 deletion mutants. Based on these, we will investigate the effect on toxisomes and Tri12 vesicles after deletion of FgRAB and the colocalization of FgRab within toxisomes, and Tri12 by cytological approach. . We will further study the interaction of GTP/GDP-bound forms of FgRab (FgRab, FgRab-CA, FgRab-DN) within toxisomes and Tri12 vesicles using marker protein, and screen the interaction proteins of FgRab8 by biochemical method. In addition, we will study the function of these interaction proteins by genetic analysis, and the relationship of these proteins with the secretion of DON. Our study will help us understand the mechanism how FgRab regulates the transport and secretion of DON through vesicle trafficking. Our goal is to provide a theoretical basis for clarifying the toxin production mechanism in F. graminearum, and designing more reasonable strategies to control wheat scab and reduce the risk of Fusarium mycotoxin.

Rab蛋白是真核生物重要的膜转运调控蛋白，在胞吞和分泌过程中起重要作用。禾谷镰刀菌毒素DON的合成与泌出可能与毒素体（toxisomes）和Tri12囊泡的转运、膜融合及分泌作用相关。我们前期研究发现该菌FgRAB5、FgRAB7和FgRAB8基因敲除突变体中DON产量显著下降，本项目在此基础上，通过细胞学、生物化学和遗传学方法研究FgRab突变后对DON合成毒素体和Tri12囊泡的影响，FgRab与毒素体和Tri12囊泡的共定位，不同Rab形式（FgRab，FgRab-CA，FgRab-DN）与毒素体和Tri12囊泡标志蛋白的互作关系，筛选FgRab8互作蛋白，研究其功能及其与DON分泌的关系，从而阐明FgRab是如何通过调控囊泡的合成与运输进而调控毒素DON转运与分泌的机制。研究结果将为阐明禾谷镰刀菌致病和产毒机制、设计更加合理的赤霉病防治策略及防控镰刀菌毒素风险提供理论依据。

真核生物中RabGTPase (Rabs蛋白)是重要的囊泡转运蛋白，分别在胞吞和分泌过程中起重要作用。禾谷镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的合成与分泌可能与毒素(toxisomes)和Tri12囊泡的转运、膜融合及分泌过程相关。我们前期研究发现，禾谷镰刀菌中FgRAB5、FgRAB7和FgRAB8基因敲除突变体DON产量显著下降。在此基础上，本项目进一步发现上述突变体中DON合成相关TRI基因(TRI1、TRI4、TRI5、TRI12、HMR1以及调控基因TRI6和TRI10)表达水平均明显下调，通过共聚焦显微镜观察不到Tri1-GFP和Tri4-GFP标记的毒素体，但内质网结构正常；对FgRab5、FgRab7和FgRab8相应鸟苷酸交换因子GEF的研究表明，它们对DON合成与分泌的影响与FgRabs一致，因此，我们认为FgRabs及其 GEFs主要通过调控DON合成相关TRI基因的表达来调控DON毒素的合成。我们还发现，TRI12缺失突变导致菌丝体和分泌物中DON含量以及其余TRI基因表达水平显著下降，说明Tri12不仅影响了 DON的分泌，还通过调节TRI基因的表达来调控DON毒素的合成。.通过亲和层析和质谱联用技术，我们筛选到696个FgRab8候选互作蛋白及60个FgRab5与Tri4共同的候选互作蛋白，其中包括许多囊泡介导的转运蛋白、Actin蛋白和乙酰辅酶A合成酶等，进一步的功能研究还在深入展开。此外，我们还研究了 FgRab8的GEF蛋白FgSec2、FgRab1以及多泡体途径相关蛋白 ESCRT组件在禾谷镰刀菌中的生物学功能，结果表明它们都能调控禾谷镰刀菌的生长发育、致病性及DON毒素的产生。.总之，本项目较好地完成了预定目标，较为全面地解析了禾谷镰刀菌囊泡形成和转运与DON毒素合成和分泌的关系，为后期开发靶向防治赤霉病和DON毒素危害的新药剂提供了潜在的靶标和理论支撑。