南极磷虾肽抑制氧化应激介导骨密度降低的结构表征及作用机制研究

The biomass of Antarctic krill is huge, and Antarctic krill are rich in proteins with high quality. Peptide enzymatically hydrolyzed from Antarctic krill (AKP) has a promising development prospect due to its various biological activities. Our previous study indicates AKP could protect osteoblast against oxidative stress and improve femur bone density in rats. However the mechanism is not clearly demonstrated. In this project, AKP with high-activity is purified by biochemical separation technology via bioassay-guided method, and the structrual characteristics is identified by tandem mass spectrometry. We establish oxidative stress cell model and mice model. The effects of AKP on the levels of endogenous antioxidant enzymes, ROS, bone turnover markers and bone density are examined. On this basis, the transcription and translation of FoxO3 is regarded as the key point to investigate the impact of AKP on the levels of gene regulation and protein expression by qRT-PCR, Western blot and dual-luciferase reporter gene assay. The underlying mechanism of AKP involves in manipulation of FoxO3/Wnt pathway in bone density loss mediated by oxidative stress is elucidated from a molecular level and the structure-activity relationship is explored. This project aims to provide theoretical support for the exploration of the bioactive values of Antarctic krill protein, and the high-value application of Antarctic krill peptide.

南极磷虾资源丰富，富含优质蛋白，由其制备的南极磷虾肽（Antarctic krill peptides, AKP）具有多种生物活性，应用前景广阔。课题组前期通过可控酶解制备AKP，发现AKP可抑制成骨细胞氧化损伤并提高大鼠股骨骨密度值，但作用机制尚不明确。本项目采用活性追踪检测，通过生化分离技术纯化高活性AKP，并应用串联质谱进行结构表征；分别构建细胞与动物氧化应激模型，探明AKP对内源性抗氧化酶、活性氧水平、骨转换标志物、骨密度值等生物学功效的影响；在此基础上，以FoxO3的基因转录和蛋白表达为切入点，运用qRT-PCR、蛋白免疫印迹和双荧光素酶报告基因系统分析AKP对细胞和动物基因调控及蛋白表达水平的影响，从分子水平阐明AKP基于FoxO3/Wnt通路抑制氧化应激介导骨密度降低的作用机制，进而确定其构效关系。本项目研究为挖掘南极磷虾蛋白生物价值、拓宽南极磷虾肽高值化应用提供了理论基础。

骨质疏松症是一种常见的骨代谢疾病，近年来研究发现氧化应激(oxidative stress，OS)作为主要病因之一在骨质疏松症的发生发展中起着重要作用。目前治疗骨质疏松症的相关产品虽然种类较多，但长期服用普遍具有一定的副作用，因此有必要以抑制氧化应激为切入点，寻找安全、新型的抗骨质疏松生物活性物质。本项目研究主要围绕以下几个方面进行：（1）前期通过响应面法优化制备南极磷虾肽（Antarctic krill peptide, AKP），并对其氨基酸组成和主要肽段序列进行分析。同时制备磷酸化南极磷虾肽(Phosphorylated Antarctic krill peptide, P-AKP)，对其体外抗氧化活性进行比较和评价。结果表明，AKP与P-AKP均有良好的羟自由基与DPPH自由基清除能力，且P-AKP的清除效果优于AKP。（2）建立成骨细胞氧化应激模型，探究AKP与P-AKP对H2O2诱导的MC3T3-E1细胞氧化损伤的保护效果及机制。结果表明AKP与P-AKP可有效抑制氧化应激细胞模型中活性氧自由基（ROS）与丙二醛（MDA）水平的上升，从而提高超氧化物歧化酶（SOD）与过氧化氢酶（CAT）活力（P＜0.05），且剂效关系明显。H2O2带来的氧化损伤对MC3T3-E1细胞成骨活性产生显著抑制作用，而AKP与P-AKP能够通过有效上调碱性磷酸酶（ALP）、I型胶原蛋白和骨钙素mRNA的表达水平，并下调FoxO3a及RANKL的表达从而逆转H2O2对细胞增殖、分化和矿化带来的影响，且P-AKP效果优于AKP。（3）利用去卵巢大鼠模型研究AKP与P-AKP的提高骨密度活性。结果表明AKP与P-AKP处理组可有效缓解骨代谢失衡后的高骨转换症状，同时上调血清中SOD水平（P＜0.05）。与OVX组相比，AKP与P-AKP能够显著提高股骨近端处骨密度值（P＜0.05）。HE染色结果显示AKP与P-AKP能够增加松质骨骨小梁数量、恢复网状结构从而有效修复骨质疏松症大鼠的骨组织结构。本研究为南极磷虾蛋白的高值化利用和食源性抗骨质疏松肽的开发提供了一定的理论基础。