智能温敏多肽的生物合成及作为药物载体的分子机制初探

Thermal-sensitive elastin-like polypeptides (ELPs) as novel drug carrier have a broad application prospect in cancer treatment. However, there are several key problems in the research of ELPs, including insufficient exogenous expression level, unclear rational control and change regularity of transition temperature, ambiguous molecular mechanism of phase transition behavior, and immature application for drug carrier. Based on these problems, this project will carry out the researches on theory and application of ELPs. 1) In terms of codon degeneracy, gene sequence of ELPs will be designed to relieve transport pressure of the specific aminoacyl-tRNA and improve the level of heterologous expression; 2) Transition temperature of ELPs will be controlled precisely by gene design to identify change regularity between transition temperature and amino acid composition and molecular weight; 3) Molecular mechanism of reversible phase transition behavior will be determined by using circular dichroism, nuclear magnetic resonance and molecular dynamics simulation in structure and conformation level; 4) Recombinant ELPs as drug carrier in combined with drug molecules will be prepared as slow-release drug for treatment of animal solid tumor. This study will provide new research idea and theoretical basis in development of novel smart thermal-sensitive biological carrier and clinical application of cancer treatment.

温敏类弹性蛋白多肽（ELPs）作为新型药物载体，在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。然而，目前ELPs的研究中尚存在的关键问题包括：外源表达水平不理想、相变温度的理性控制及变化规律不明确、相变行为的分子机理存在分歧、载药应用尚处于起步阶段。本项目拟针对这些问题开展ELPs的理论与应用研究。利用密码子的简并性，合理设计ELPs的基因序列，缓解特异氨酰tRNA的转运压力，以有效提高外源表达水平；通过基因水平设计，精确调控ELPs的相变温度，认识氨基酸组成以及分子量与相变温度之间的变化规律，以理性指导快速合成所需相变温度的ELPs；结合圆二色谱、核磁共振及分子动力学模拟技术，从结构和构象层次，以解析ELPs温敏可逆相变行为的分子机制；重组ELPs作为药物载体，结合药物分子制备温敏缓释药物，用于动物实体瘤的治疗。本研究将为新型智能温敏生物载体的开发及其癌症治疗的临床应用提供新的研究思路及理论基础。

温敏多肽作为新型生物医学材料，在临床诊断和治疗中具有广阔的应用前景。本项目根据大肠杆菌密码子的偏好性和简并性，合理设计不同疏水性客座氨基酸的单体基因。针对多肽基因的特殊性，建立了依次插入单体基因法、递归定向连接法、重叠延伸滚动循环扩增法，获得了具有不同客座氨基酸和分子量多肽基因库，为构建类似复杂的重复基因提供了新的思路，同时构建了一种新型双向T载体，用于多肽基因库的快速TA克隆和正、反双向表达。利用大肠杆菌表达系统，通过菌体培养和诱导表达，实现了多肽在胞内的可溶性表达。基于多肽独特的可逆相变特性，仅需温度/盐介导的可逆相变循环的非色谱纯化法，即可分离纯化获得高纯度的重组多肽。多肽相变温度的变化与内部客座残基的疏水性强弱和分子量大小、以及外部多肽浓度和离子浓度均呈负相关，这一规律为理性指导精确控制并快速合成具有特定相变温度的多肽提供了理论基础。以温敏多肽作为标签与葡聚糖内切酶融合表达后，赋予融合蛋白可逆相变的特性，且不影响葡聚糖内切酶自身的活性与功能，利用可逆相变循环法即可分离纯化融合蛋白，与传统色谱纯化相比，这种非色谱纯化法具有简单快捷、处理量大、回收率高、纯化成本低、适用范围广的优势。以温敏多肽作为新型液体栓塞剂，通过体外栓塞模拟和体内股动脉注射的可行性评估，为开展内镜下栓塞治疗食管胃底静脉曲张提供安全、有效、经济的生物医学栓塞材料。