在肝癌中甲胎蛋白参与调控细胞自噬的分子机制及其意义

Function of cytoplasmic AFP as a signal factor in the growth of tumor cells has been well defined. However, its underlying mechanism and significance in the hepatocellular carcinoma in autophagy is remains elusive. Our preliminary results indicate that in hepatocellular carcinoma cells, AFP can upregulate the expression of autophagy related genes Beclin1 and mTOR, and accompanied by an increase of autophagy level. We also found that AFP colocalized with RAR and PTEN in cytoplasmic. All the Results suggest that AFP may through RA-RAR and PI3K/Akt two pathways, playing an important role in the regulation of autophagy. We will further explore the mechanism of AFP involved in the autophagy and the development of hepatocellular carcinoma, to confirm that AFP is an key signal molecule in autophagy in hepatocllular cells., and to provide evidences for clinical therapeutic strategy of hepatocellular carcinoma .

虽然已知AFP在促进肝癌细胞增殖中发挥信号分子样作用，但其在肝细胞癌自噬中发挥的生物学作用机制及意义并不清楚。本项目的初步实验结果发现，在胞内AFP可以上调自噬相关基因Beclin1和mTOR的表达，并促进肝癌细胞的自噬水平，同时还发现胞浆中AFP与RAR和PTEN存在共定位现象。结果提示我们AFP可能通过参与RA-RAR和PI3K/Akt这两条信号通路，在细胞自噬的调控中发挥了重要的作用。本项目将在此基础上，深入探讨AFP参与调控细胞自噬的机制及其与肝癌发生发展的关系，确定AFP在细胞自噬信号网络中的关键分子的位置，并为临床上提供以AFP为靶点治疗策略的实验理论基础。

背景和目标：目前已经有很多的研究证实了甲胎蛋白在肝癌当中可以作为一个信号分子去调控肝癌细胞的增殖和抗凋亡。但是对于甲胎蛋白在细胞自噬过程中的作用，目前尚无报道。我们这一个项目主要是研究了胞浆当中的甲胎蛋白与肝癌细胞的自噬之间的关系。.主要研究内容：为了深入研究AFP和细胞自噬之间的关系，我们采用了HepG2,PLC/PRF/5和HLE细胞进行了研究。采用免疫荧光观察LC3颗粒聚集情况去判断细胞的自噬水平；免疫印迹实验观察自噬相关蛋白LC3和P62等的变化。采用免疫共沉淀的确定AFP与PTEN和RAR的相互作用情况。免疫荧光观察共定位情况。我们采用流式细胞术观察了肝癌细胞的周期，凋亡，划痕实验检测了细胞迁移的影响，CCK-8实验检测了细胞的增殖变化。.重要结果：在 PLC/PRF/5 细胞中，我们观察到AFP可以与PTEN和RAR相互作用，当采用siRNA敲低AFP的表达水平之后AFP与PTEN和RAR的结合能力也有所减弱。在HLE细胞中，因为本身AFP阴性的原因，我们观察不到AFP与PTEN和RAR之间的相互作用，但在HLE细胞中过表达AFP之后，随着AFP的再出现，AFP与PTEN和RAR的结合也被检测到。AFP与PTEN之间的相互作用，影响了 PI3K/Akt/mTOR 信号通路，免疫印迹实验显示，当AFP敲除之后，结合PTEN减少，PI3K/Akt/mTOR 信号通路关键分子的磷酸化水平都受到了抑制，而当HLE细胞中，AFP 水平升高，结合PTEN能力增强，PI3K/Akt/mTOR 信号通路关键分子的磷酸化水平都有了明显的提高，随之观察细胞的自噬水平也有相应的变化。另一方面在肝癌细胞中加入全反式维甲酸之后，观察到自噬相关蛋白ATG7的RNA和蛋白水平都与明显的增高，随着AFP与RAR之间的结合，抑制了RAR的入核，也抑制了ATG7的水平，从而影响细胞自噬，目前这部分数据还在进一步的整理和完善当中。流式细胞术结果显示，AFP水平升高的时候，细胞周期明显促进，抗凋亡能力也所有增加，细胞增殖能力上升，迁移能力也随之上升，加入雷帕霉素，mTOR的特异性抑制剂之后，叠加效应明显，反之则不然。.意义：AFP在肝癌细胞的自噬中发挥了重要的作用，对于我们认识AFP及临床治疗提供了理论依据。