基于穴区成纤维细胞生物学响应的针刺提插手法补泻效应机制研究

Reinforcing and reducing effect of acupuncture manipulations has been verified by clinical and experimental researches, while its mechanism is not clear. Fibroblast is a key link in the transforming process from mechanical signal into biological signal. Based on previous studies, this study adopts orthogonal design and factorial analysis, combining 3 factors(frequency, direction and stimulation duration) and 3 levels into 9 kinds of acupuncture manipulations which are applied in the point LI11 to treat fever rabbits. Fibroblast shape in acupoint area, Purine receptor signaling molecule ATP, mechanical signal transduction factors PGE2 and NO and extracellular matrix factor TGF-β1 and MMP-1 which are produced and synthesized by fibroblast, anal temperature, endogenous pyrogen IL-1β,IL-6,TGF-β in serum and central heating medium PGE2,cAMP,AVP and α-MSN in hypothalamus are observed. The purpose of this project is to find out primary and secondary factors which influence reinforcing and reducing effect and the interaction between various factors, analyze relationship between fibroblasts in acupoint area and reinforcing and reducing effect on target organs, reveal the important role of fibroblasts in mechanical signal transformation process of acupuncture manipulation, and provide experimental basis for clinical application and inheritance of acupuncture manipulations.

针刺手法的补泻效应已经得到临床和实验验证，然而效应机制并不明晰。结缔组织成纤维细胞是将机械信号转化为生物学信号的关键环节。在课题组以往研究基础上，本研究采用正交试验设计和析因分析方法，在曲池穴选取不同频率、用力方向和刺激时间的3因素3水平治疗条件组合的9种针刺手法方案治疗内毒素致热家兔，观测穴区成纤维细胞形态，成纤维细胞合成和分泌嘌呤受体信号分子ATP、机械信号转导因子PGE2、NO和细胞外基质影响因子TGF-β1、MMP-1的功能，以及家兔肛温、内源性致热因子IL-1β、IL-6、TGF-β和下丘脑中枢性发热介质PGE2、cAMP、AVP、α-MSN的含量。旨在探讨影响提插手法补泻效应的主次因素及各个因素之间的交互作用，分析穴区成纤维细胞形态功能改变与靶器官补泻效应的相关性，从细胞生物力学角度揭示成纤维细胞在针刺手法力学信号转换中的重要作用，为临床针刺补泻手法的应用和传承提供实验依据。

本研究旨在通过提插手法的正交设计研究筛选最优手法刺激方案；研究针刺手法对穴区皮下成纤维细胞形态和功能的影响及其与针刺效应的相关性，探讨针刺手法力学信号传导机制。将120只雄性新西兰兔随机分为12组，空白组（N）、模型组（M）和留针组（A）各10只，手法组90只，应用L9（34）正交设计分为9组，每组10只。留针组针刺曲池穴留针30min，手法组留针期间采取相应的提插手法。静脉注射内毒素法建立发热模型。热源仪监测肛温4h；Elisa法检测血清内源性致热因子IL-1β、IL-6、TNF-a，免疫组化法检测下丘脑中枢性发热介质cAMP、AVP蛋白含量，RT-PCR检测cAMP、AVP基因含量；针刺治疗后体外培养曲池穴区成纤维细胞，Elisa法检测上清液PGE2、NO、 TGF-β1、MMP-1含量，生化法检测ATP含量。结果：1. 造模后，家兔肛温、血清IL-1β、IL-6、TNF-a含量、下丘脑cAMP、AVP蛋白和基因含量、穴区成纤维细胞上清液NO、 TGF-β1、MMP-1含量较空白组显著增加。2.留针组针刺后4小时血清和下丘脑发热因子含量较模型组显著降低。3.作用力方向对家兔肛温、血清和下丘脑发热因子的影响均有统计学意义，重提轻插为最佳刺激方式；提插手法频率对血清IL-1β含量的影响有统计学意义，同时对成纤维细胞上清液PGE2含量的影响有统计学意义，60次/分为最佳刺激方式；提插手法施术时间对家兔肛温、血清IL-6、TNF-a、下丘脑cAMP、AVP基因和蛋白含量的影响有统计学意义，同时对成纤维细胞上清液PGE2、NO、ATP含量的影响有统计学意义，3min为最佳刺激方式。4. 与留针组相比，最佳手法刺激组（MA：A3B2C1组）肛温、血清IL-1β、IL-6、TNF-a、下丘脑cAMP、AVP基因和蛋白含量显著降低；穴区成纤维细胞上清液PGE2、NO、ATP含量显著升高。结论：1.针刺曲池穴治疗实热证家兔的最佳提插手法刺激参数为重提轻插、60次/分、刺激3min。2.提插手法可以增强针刺退热抗炎效应。其中提插作用力方向、刺激时间对疗效的影响最大，其次为频率。3. 针刺可以促进成纤维细胞分泌嘌呤受体信号分子ATP、机械信号转导因子PGE2、NO，可能是针刺手法力学信号传导机制之一。