心肌细胞L型钙通道CaV1.2的新调控蛋白PLM的功能研究

L-type calcium channels (LTCC) are the main voltage-dependant calcium channels in the heart, which are participate in the formation and maintenance of the plateau phase of the cardiac action potential. Activation of LTCC allows a small amount of Ca2+ influx. In the cytosol, Ca2+ trigger additional Ca2+ to release through ryanodine receptors (RyRs) in the sarcoplasmic reticulum (SR). This process plays a key role in cardiac excitation-contraction coupling (ECC). Our previous studies found a new regulator of LTCC, phospholemman (PLM). We experimentally demonstrated that PLM co-localized and co-immunoprecipitated with LTCC in the membrane of exogenous expression vector HEK 293 cells and PLM could fine tune the kinetics of LTCC. However, the significance of regulation of LTCC by PLM under physiological condition remains unknown. The purpose of this project is to detect the effects of PLM overexpression or downregulation on LTCC in rat myocardial cells. And PLM is a major sarcolemmal substrate for phosphorylation in cardiac muscle. We use site-directed mutagenesis to replace the potential phosphorylation site and analyze the changes of the effects induced by PLM mutants. We hope to provide the experimental basis for the physiological role of PLM in the regulation of LTCC and also establish a new molecular target for the treatment of heart failure and cardiacarrhythmia induced by it.

L型钙通道(LTCC)是心肌中主要的电压依赖性钙通道，参与心肌细胞动作电位平台期的形成和维持。激活LTCC引起少量钙离子内流，后者触发大量钙离子从肌浆网中释放出来，这一过程在心脏兴奋收缩偶联中起着关键作用。我们前期研究发现了LTCC的一个新的调控蛋白phospholemman(PLM)，并实验证明在外源性表达载体HEK 293细胞中PLM与LTCC在细胞膜上共定位并相连接，PLM可以调节LTCC的电生理特性。但在生理情况下PLM对LTCC的作用却不清楚。本项目通过在大鼠心肌细胞中过表达和抑制表达PLM来分析它对LTCC的调节作用。又PLM是心肌中一种主要的磷酸化底物，本项目将PLM不同磷酸位点一一突变来观察它对LTCC的调节作用有无变化。为更全面地了解PLM调节LTCC的生理功能提供实验依据，也为治疗心力衰竭和心力衰竭后心律失常提供新的分子靶点。

研究背景：Phospholemman(PLM)是心肌细胞中一种重要的磷酸化底物，可以被蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)磷酸化。前期研究发现PLM与心肌细胞膜上L型钙通道(L-type calcium channel, LTCC)相连并改变其通道动力学特性，但PLM不同磷酸化状态对LTCC的影响还不清楚。本项目在HEK 293T细胞中转染PLM磷酸化位点突变质粒，用膜片钳记录L型钙电流(ICa(L))的变化。.研究内容：用丙氨酸(alanine, A)和天冬氨酸(aspartic acid, D)替代PLM 62、63、68号位丝氨酸(serine, S)、69号位苏氨酸(threonine, T)，构建PLM去磷酸化质粒(6263AA、6869AA、AAAA)和PLM磷酸化质粒(6263DD、6869DD、DDDD)。将编码LTCC的质粒分别与编码野生型PLM(WT PLM)和突变型PLM的质粒转染HEK 293T细胞，待目的蛋白表达后，用全细胞膜片钳技术记录ICa(L)并分析磷酸化和去磷酸化PLM对ICa(L)的影响。.研究结果：WT PLM显著减慢LTCC的激活和灭活过程，同时加快LTCC的电压依赖性失活过程。模拟PLM磷酸化的突变质粒(6263DD、6869DD、DDDD)可以增加ICa(L)电流密度。62、63号位丝氨酸磷酸化状态改变PLM对LTCC的激活作用，表现为：6263AA促进了PLM减慢LTCC激活的作用，而6263DD抑制了该作用。68号位丝氨酸、69号位苏氨酸磷酸化状态改变PLM对LTCC的电压依赖性失活作用，表现为：6869DD促进了PLM加快LTCC失活的作用。AAAA较6263AA更加减慢LTCC的激活，而DDDD较6869DD更加加快LTCC的失活。除了AAAA，其他5种突变型PLM均抑制PLM使LTCC灭活减慢的作用。.科学意义：本研究显示PLM磷酸化加快了LTCC激活和失活过程，而PLM去磷酸化起到相反的作用。由于LTCC失活减慢与心律失常发生相关，促进PLM磷酸化可能是一个潜在的预防和治疗心律失常的方法。