基于免疫质谱技术的结直肠癌自身抗体高灵敏检测新方法的研究

Tumor itself can induce immunological reaction in body, producing auto-antibodies against tumor-associated antigens. The auto-antibodies can be used as biomarkers for early diagnostics and typing of cancer. Therefore, development of method for analyzing auto-antibodies with high sensitivity, high specificity and high throughput is crucial to perform deep investigation and clinical application of tumor-associated auto-antibodies. In this study, we aim to establish and develop novel methods to detect tumor-associated auto-antibodies by using enzymatic signal amplification, high specificity of antigen-antibody reaction and high accuracy of analytical ability of mass spectrometry, in which several auto-antibodies against colorectal cancer (CRC)-associated antigens (p53, c-myc, survivin) are used. In addition, we aim to establish and develop novel intensity-fading MS-based method for rapid screening and identifying tumor-associated antigen's epitope against its auto-antibody, which can be used to epitope typing for auto-antibody. This study can provide methods for detecting auto-antibody with high sensitivity, epitope typing of tumor-associated auto-antibodies, and thus identifying specific epitope structure that is closely related to CRC. This study has both theoretical and practical significance on early diagnostics, medical monitoring, and prognosis assessment of CRC, as well as development of tumor-associated auto-antibody assay kits and tumor vaccine.

肿瘤本身能诱导机体免疫反应，产生抗肿瘤相关抗原的自身抗体，可以作为肿瘤标志物应用于肿瘤的早期诊断。因此，发展高灵敏度、高特异性、高通量的自身抗体检测方法，是对肿瘤相关自身抗体进行深入研究和临床应用的必要条件。在本项目中，我们以三种结直肠癌相关抗原（p53，c-myc，survivin）自身抗体为对象，利用酶促反应的信号放大效应、抗原抗体反应的高特异性和质谱技术的快速、高精度分析能力，建立和发展肿瘤相关自身抗体的质谱检测新方法。针对特定肿瘤相关抗原的自身抗体，建立和发展基于强度衰减质谱技术的肿瘤相关抗原表位快速筛选、鉴定，并用于自身抗体表位分型的新方法。该项目不但能够实现对自身抗体的高灵敏检测，而且能够对肿瘤相关自身抗体进行表位分型，发现与结直肠肿瘤密切相关的表位结构谱。该项目对于结直肠肿瘤的早期诊断，治疗监控，预后评价，以及相关自身抗体检测试剂、肿瘤疫苗的开发具有重要的理论意义和应用价值。

本项目以结直肠癌肿瘤相关抗原抗体为体系，利用质谱技术研究了基于辣根过氧化物酶（HRP）的酶促放大反应的质谱分析条件，确立了底物分子与产物分子的质谱定量关系，建立了一种利用质谱信号强度对目标抗原进行间接定量的全新的分析方法。利用基于毛细管液相色谱与质谱联用技术考察了不同组织样品处理方法（新鲜组织、福尔马林固定不同时间、福尔马林固定结合石蜡包埋）对蛋白质的提取效率、不同蛋白的分布的影响。比较了三种不同的蛋白质组学提取方法（TRIZOL法，Triton X-100法，Urea法）所制备的蛋白质组样品的差异。将生物正交的点击化学技术应用于酶与抗体抗原等蛋白分子的偶联实验中，成功建立了基于点击化学技术的应用于酶、抗体、抗原等蛋白分子高效、特异的标记、富集、及质谱分析方法。利用非标记质谱技术方法分析了CRC患者的手术组织，并采用大样本对发现的与结直肠癌转移等病理过程密切相关的肿瘤相关抗原及抗体进行了血清水平的验证研究，获得了适用于结直肠癌的自身抗体联合检测组合，为结直肠癌早期诊断和个体化治疗提供高灵敏和特异性自身抗体标志物。在结直肠癌组织样本的质谱数据中发现了自身抗体来源的多肽片段，在一级结构水平定位到了抗体VDJ区差异表达序列。通过设计多重PCR扩增体系，对样品中抗体分子及B细胞受体分子进行特异性扩增，将扩增后的片段进行高通量测序，将测序后的数据与IMGT数据库中人的BCR区的序列比对，综合考察了各样品中V、J、D区，以及V-J组合、V-D-J组合的使用情况，初步发现了结直肠癌组织中具有显著性差异的自身抗体V-J组合、V-D-J组合。本项目可望对机体免疫分子的多样性的结构基础提供基于质谱技术的直接解析方法。