泛素/类泛素化修饰的分析新方法及其在禽流感病毒跨种属感染研究中的应用

禽流感病毒跨种属感染人源细胞并在其中进行复制、繁殖等过程是多因素、多层次的。在此过程中，泛素和类泛素修饰可以对多种宿主细胞靶蛋白及病毒本身进行一系列的精确调控。然而，缺乏高通量、高特异性检测手段是制约我们对特定病理或生理状态下细胞中的泛素和类泛素修饰进行系统性研究的一个重要原因。在本项目中，我们将免疫学、质谱技术、以及组学的概念和研究策略引入泛素和类泛素修饰的研究中，建立并发展特异性的内源性泛素和类泛素修饰的富集和分析方法，并利用建立的方法研究禽流感病毒跨种属感染过程所引起的病毒蛋白及宿主蛋白可能的泛素和类泛素修饰的变化，以及宿主细胞中游离泛素和类泛素分子本身的非泛素修饰的变化，使我们能从泛素和类泛素修饰的水平上对禽流感病毒跨种属感染人源宿主的行为有更深入的认识，不仅有助于了解禽病毒逃避免疫监视并形成持续感染或对机体造成损害的分子机制，更重要的是还可为寻找新的药物作用靶点奠定基础。

泛素和类泛素化修饰在病原微生物与宿主之间相互作用的过程中发挥着极其重要的作用，可以对多种宿主细胞靶蛋白及病毒本身进行一系列的精确调控。本课题首先对泛素和类泛素等翻译后修饰蛋白质组的富集和分析方法进行了研究，建立了适用于含有高致病性流感病毒的细胞样品的蛋白质组提取方法，并与其它蛋白质组提取方法进行了比较。建立了基于修饰蛋白富集和修饰多肽富集相结合的串联富集方法，显著降低了非修饰信号的干扰，提高了修饰多肽的质谱鉴定效率。对病原微生物与宿主之间相互作用过程中泛素化和类泛素化修饰相关蛋白进行了系统研究，鉴定了一系列泛素化蛋白（230个）、类泛素SUMO1化蛋白（42个）。发现了在鸡胚培养的流感病毒颗粒中的12个宿主蛋白，并分析了其中的翻译后修饰状态。利用高分辨质谱技术，获得了流感病毒蛋白的高分辨质谱图谱，鉴定了主要病毒蛋白的相互作用宿主蛋白，得到了100多种与NP蛋白相互作用的宿主蛋白；发现了泛素或类泛素等修饰相关蛋白分子如DBNL、14-3-3、Plectin的多种翻译后修饰状态。建立了基于生物正交反应标记与免疫质谱技术相结合的动态蛋白质组的高灵敏检测方法，发现了流感病毒感染宿主细胞过程中病毒蛋白以及泛素和类泛素等翻译后修饰相关蛋白的瞬时动态变化规律，表征了流感病毒主要蛋白的动态周转情况，发现了未曾报道的一些重要的与病原微生物感染密切相关的宿主蛋白。本研究有助于对病毒等病原微生物与宿主细胞的相互作用有更全面的认识，更重要的是还可为寻找新的药物作用靶点提供一些思路。