基于信号分子转换的miRNA质谱检测新方法研究

MicroRNA (miRNA) is a class of endogenous non-coding single-stranded RNA, widely present in living bodies. MiRNAs are involved in various cellular processes and have become important biomarkers and therapeutic targets for cancer and other diseases. Detection of miRNAs in biological specimens is highly significant for understanding their biological functions and early diagnosis of disease. Mass spectrometry (MS) has shown its potential to study bioactive molecules, because of its high sensitivity, high selectivity, and wide dynamic range. Because of the low ionization efficiency for miRNA, this project will develop a strategy that enable the detecting of small molecule reporter instead of direct analysis of miRNAs, which have the advantages of higher sensitivity and lower requirements for the instrumentation. This project will aim to develop label-free and highly sensitive mass spectrometry-based biosensing approaches for quantification of miRNAs. Signal amplification methods and reporter enrichment will be applied in miRNA detection to improve the sensitivity. On this basis, we will optimize the design of the DNA probes and simplify the sample pretreatment procedures before mass spectrometry analysis to enhance the sensitivity, selectivity and operability, in order to meet the analytical needs of a wide range of normal and patient body fluid samples. We believe this developed method may be possibly used for early disease diagnosis and prognosis, and also pave the way for development of innovative drugs.

MicroRNA（miRNA）是一类内源性非编码单链小RNA，参与细胞生长的一系重要过程，目前已成为癌症等疾病的重要标志物和治疗靶点，miRNA的灵敏检测对其生物功能的研究和临床疾病诊断意义重大。质谱具有高灵敏度、快速、专一、高通量的优点，但是质谱直接检测miRNA灵敏度很低，针对这一难题，本项目将采用信号转换策略，将电离效率远高于miRNA的小分子作为质谱定量的信号分子，同时集成三种核酸信号放大技术、目标物富集方法，构建基于质谱新型生物传感技术的非标记miRNA检测方法，并将其应用于细胞等生物样品的分析。上述质谱方法能大大提高miRNA的检测灵敏度，且具有准确、稳定、非标记检测、无需经过色谱分离等特点，从而满足生物样本中低含量miRNA的分析需求。该项目的成功实施，将有望为癌症等疾病发病机制的研究及早期诊断、预后疗效监测及新药研发提供有力的研究手段。

miRNA是诸多疾病和癌症的重要生物标志物，但由于miRNA在不同物种和组织中表达水平的差异很大，能准确、灵敏地检测miRNA的含量显得尤为重要。虽然目前很多先进的质谱仪器也被用于生物大分子的直接分析，但是使用小分子化合物作为检测生物大分子的信号分子不仅能够提高检测的灵敏度，更降低了对质谱仪器性能的要求。.本项目利用质谱作为检测手段，提出基于质谱分析的信号分子转换策略，并结合信号放大技术和目标物富集方法，建立了非标记检测生物体内miRNA的分析方法。具体完成了以下内容的工作：1）采用信号分子转换策略，将质谱响应远高于miRNA的小分子-腺嘌呤作为信号分子，建立灵敏、快速的miRNA非标记质谱检测新方法；2）建立目标物富集方法及样品前处理方法，实现目标物的快速提取及去除生物样品杂质的目的；3）引入有效的信号放大技术如多A碱基探针的使用、等温扩增，合理设计miRNA模板识别平台，达到检测灵敏度大幅提高的目的，以满足不同表达水平的生物样本中miRNA的灵敏、准确的分析需求。.研究发现，1）将目标miRNA的信号转换为易电离的小分子化合物的质谱信号可以大幅提高检测灵敏度，采用酸水解释放腺嘌呤作为信号分子的策略比酶解方式更为经济，特异性也更高；2）针对不同的生物样本可以采用不同的信号放大策略，以期在满足检测灵敏度的同时大幅缩短总分析时长；3）基于固液分离的前处理方式可有效将目标待测物富集并去除干扰物，但此前大多数针对miRNA的检测方法都是先将DNA探针或miRNA固定在微球表面，之后再进行一系列的反应。该过程中杂交效率和速率会受到微球表面空间位阻的影响，寡核苷酸序列的自由度也会受到一定程度的限制，二我们选择在液相中进行完目标miRNA扩增反应之后，利用固定在96孔板上的DNA捕获探针将扩增产物高效且高特异性地从混合溶液中提取出来。.本项目的提出的研究策略弥补了质谱在直接检测miRNA灵敏度低的问题，该策略也拓展了质谱在其它寡核苷酸生物标志物及药物检测中的应用。