长非编码增强子eRNA在CTCF介导的染色质高级拓扑结构调控基因表达中的功能机制研究

There are far more enhancers than promoters in the mammalian genomes and enhancers are central for precise spatiotemporal gene expression during tissue development and organogenesis. Recent studies have found prevailing transcriptions of long non-coding eRNAs from enhancers that are important for gene regulation but the mechanisms of eRNA functions remain obscure. We recently discovered that the relative orientations and locations of CTCF sites in enhancers and promoters determine the directionality of higher-order chromatin looping and regulation of gene expression. In this grant application, we will characterize the enhancer and super-enhancer eRNAs in the protocadherin gene clusters and dissect their roles in specific long-distance enhancer-promoter looping and in gene regulation through CTCF/cohesin-mediated chromatin topological domains. These studies should have important implications for mechanisms of non-coding RNA function in gene regulation through chromatin architectural proteins such as CTCF.

哺乳动物基因组中增强子的数量远远大于启动子，并且增强子在组织器官发育中对于基因精准时空表达起到关键作用。近年的研究发现增强子普遍转录长非编码eRNA，其在基因信息传递过程中可能发挥重要作用但具体机制还不清楚。申请人实验室最近发现染色质架构蛋白CTCF与增强子的方向性结合对于原钙粘蛋白增强子与启动子的远程特异性交互作用至关重要，解决了长期悬而未决的增强子方向性问题（Cell，162，900-910. 2015)。我们将详细鉴定原钙粘蛋白增强子和超级增强子eRNA，阐明其在增强子与启动子特异性远程交互作用以及CTCF等染色质架构蛋白调控基因表达的机制。这些研究对于长非编码RNA在基因信息传递过程中的调控作用具有重要意义。

原钙粘蛋白（PCDH： protocadherin）基因簇所编码的原钙粘蛋白质群是广泛分布于中枢神经系统的一类跨膜蛋白，在神经系统发育中具有重要的功能。成簇的原钙粘蛋白基因座包含成串排列的基因所组成的三个紧密相连的基因簇，其线性基因组结构包含众多的可变区外显子构成的可变区以及下游的包含一个由三个恒定区外显子构成的恒定区。我们发现调控PCDHα基因簇的增强子HS5-1区域具有eRNA的转录，我们研究了eRNA转录本转录过程对PCDHα基因表达调控及其参与染色质长距离成环的机制。..利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对HS5-1 eRNA进行编辑，删除eRNA的转录起始位点和插入转录终止信号，建立了eRNA表达缺陷的细胞模型。使用RNA-seq技术进行转录组测序在细胞模型发现HS5-1 eRNA能调控PCDHα基因的表达。我们发现eRNA能够影响染色质的长距离成环过程。通过使用染色质长距离成环捕获技术来探究eRNA与染色质成环的关系，结果发现eRNA的转录受到破坏后，染色质成环也会受到影响。..eRNA不仅影响染色质成环，还影响组蛋白甲基化和乙酰化。使用染色质免疫共沉淀技术检测其对RNA聚合酶II和组蛋白修饰的影响，RNA聚合酶II的结合对HS5-1增强子的活性非常重要。删除eRNA的转录起始位点和插入转录终止信号都会使RNA聚合酶II的结合减少，同时启动子活性标签H3K4me3在PCDHα基因簇亚型及其增强子HS5-1位置的结合都减少，说明eRNA以某种方式能够参与调控启动子的活性。同时，增强子活性标签H3K27ac在HS5-1增强子处的活性会减少，说明eRNA能够影响HS5-1增强子的活性。..HS5-1 eRNA的转录本和转录过程能够调控PCDHα基因的表达，影响增强子与启动子之间的染色质长距离成环，且影响启动子和增强子活性，这是从长非编码增强子RNA的角度来诠释调控PCDHα基因表达的分子机理，为研究原钙粘蛋白PCDH基因簇表达的分子机制提供新的方向。