CTCF与染色质高级结构形成及其调控基因表达的机理研究

Genomes are organized into complex 3D structures in the nucleus. Topologically associating domains (TADs) are the basic units of this organization, which are closely related to gene expression regulation and development, but the detail mechanism is still unknown. Many diseases and cancers are found to be the results of disrupted TADs, which cause the mal-regulation of causal genes. Chromatin architectural protein CTCF recruits Cohesin to shape the genome architecture. We found that CTCF binds to DNA with directionality, which decides the orientations of long-range DNA looping. In this project, we will insert mouse regulatory elements with CTCF binding site（or sites）into human TADs to detect the architectural changes of the TAD, and the altered of gene expression level. Through inserting different regulatory elements and comparing their effects to DNA architecture and gene expression, we will find effective insulators to control gene expression. This project will shed new light on the 3D-genome-based gene regulation mechanism.

基因组在细胞核中以三维结构存在，拓扑结构域是三维结构的基本单元，这种结构提供了基因表达调控的基础，但具体机理还有待研究。由于结构域的破坏所导致的基因异常表达，是多种疾病和癌症的发病原因。染色质结构蛋白CTCF通过招募Cohesin参与拓扑结构域的形成，CTCF结合DNA的方向性决定了染色质远距离相互作用的方向性。本研究将利用CRISPR/Cas9介导的同源重组，在拓扑结构域的不同位点中插入含CTCF位点的调节元件，通过染色质构象捕获技术检测插入元件、增强子、启动子三者的相互作用，以及拓扑结构域DNA高级结构的变化，探索CTCF对高级结构的调节作用。通过检测插入元件前后基因表达水平的变化，探索染色质构象对基因表达的调控机理。最后，我们将比较不同的插入元件对拓扑结构和基因表达的影响，寻找有效阻断增强子-启动子互作的绝缘子序列特征，实现基因的可控性表达，阐明高级拓扑结构调控基因表达的机理。

CTCF是哺乳动物基因组中的绝缘子结合蛋白，基因组中含有许多的CTCF结合位点，其中很多是串联排列的。利用CRISPR DNA片段编辑，结合高灵敏度的染色体构象捕获，我们发现正向、反向、正向-反向、以及反向-正向的CTCF位点，只要位于原钙粘蛋白（Pcdh）和β-珠蛋白簇中的增强子和启动子之间，都能有效阻断下调基因的表达。其发挥绝缘作用的机理是通过形成不同方向的染色质环，从而起到增强子阻断绝缘体的作用，这与增强子是否含有CTCF位点无关。此外，计算机模拟结合小鼠遗传学实验，以及dCas9阻断实验显示，串联排列的CTCF位点对于细胞群体中启动子的平衡选择起重要作用，使得Pcdh和免疫球蛋白重链（Igh）基因在单个细胞中能够随机组合表达。此外，串联排列的CTCF绝缘体促进了与远端CTCF位点的长程染色质相互作用，这与粘连蛋白cohesin的“环挤压”模型一致。最后，在全基因组范围内，基因表达水平与位于增强子和启动子之间的CTCF绝缘体呈负相关。因此，单个CTCF绝缘子确保适当的启动子激活，而串联排列的CTCF拓扑绝缘子决定了平衡的空间接触和启动子选择。这些发现对于阐明CTCF在三维基因组折叠和基因调控中的作用有着重要的意义。