冬凌草甲素抑制caspase-9诱导喉癌细胞凋亡的机制研究

祖国医学认为，热毒是肿瘤发生、发展的一个重要因素。清热解毒法，是恶性肿瘤中医治疗的基本法则之一。清热解毒类中药冬凌草临床上主治咽喉炎，且其主要活性成分冬凌草甲素具有显著的抗肿瘤作用，提示冬凌草甲素可能对喉癌具有治疗作用。前期工作中我们通过体内、外抗肿瘤实验首次证实冬凌草甲素对人喉鳞状细胞癌的生长具有明显的抑制作用，当我们深入研究冬凌草甲素抗喉癌作用机制时却意外地发现，凋亡诱导因子caspase-9不但不起到促进凋亡作用，反而在细胞凋亡中发挥保护作用，同时发现 caspase-9参与并促进冬凌草甲素诱导的自噬，由此我们推测caspase-9促进自噬对抗凋亡是其发挥保护作用的主要机制，本项目将设计实验对此进行验证，所获结果将揭示冬凌草甲素抑制caspase-9诱导喉癌细胞凋亡的机理，为其抗肿瘤临床应用奠定坚实的理论基础，同时为从清热解毒类中药的传统临床功效入手发掘抗肿瘤药物提供范例。

清热解毒类中药冬凌草临床上主治咽喉炎，且其主要活性成分冬凌草甲素(Oridonin,Ori)具有显著的抗肿瘤作用，提示Ori可能对喉癌具有治疗作用。前期工作中我们通过体内、外抗肿瘤实验首次证实Ori对人喉鳞状细胞癌的生长具有明显的抑制作用，并发现Ori诱导人喉癌HEp-2细胞凋亡的典型特征是激活了caspase-9非依赖的线粒体凋亡途径。本课题深入研究caspase-9 信号途径在Ori诱导的HEp-2细胞凋亡中所发挥的作用及其相关机制，所获结果不仅丰富了caspase-9蛋白酶的理论体系，同时，为针对caspase-9信号途径设计并开发相应的治疗喉癌的药物或将caspase-9抑制剂与其他传统治疗药物相联合应用于喉癌的治疗提供重要的理论依据。已发表及已投稿论文3篇。具体实验结论如下：.1. Caspase-9抑制剂 (C9i) 可增强Ori诱导的HEp-2细胞凋亡。与 C9i 的作用结果相一致，采用RNAi方法产生caspase-9 缺陷的HEp-2 细胞对Ori的敏感性增强，提示caspase-9在Ori诱导的细胞凋亡中发挥保护作用。.2. Ori作用于HEp-2 细胞可诱导细胞内活性氧(ROS)产生，ROS通过激活caspase-9非依赖的线粒体凋亡途径以及死亡受体途径诱导HEp-2 细胞凋亡。C9i 可以扩大Ori诱导的 ROS 产生而增强Ori诱导的 HEp-2 细胞凋亡，提示caspase-9抑制ROS产生从而抑制细胞凋亡是其发挥保护性机制的原因之一。.3.Ori在诱导HEp-2细胞凋亡的同时诱导细胞自噬。自噬的特异性抑制剂 3-MA 抑制了自噬促进Ori诱导的细胞凋亡，提示自噬具有对抗凋亡、保护细胞的功能。我们进一步研究发现抑制caspase-9降低了自噬，提示caspase-9 促进自噬从而对抗细胞凋亡是其发挥细胞保护性作用的原因之一。.4. 构建caspase-9 缺失细胞株以及caspase-9过表达的HEp-2细胞株，从正反两方面考察Ori作用后细胞生长抑制，细胞凋亡，细胞内ROS及自噬的变化，结果进一步证实caspase-9可通过抑制ROS同时促进自噬的途径而发挥细胞保护性作用。.5. 研究结果表明Caspase-9 可能不是通过传统的裂解方式而是通过变构作用被激活而发挥细胞保护作用。