冬凌草中冬凌草甲素、冬凌草乙素生物合成机制研究

中药冬凌草的主要药效成分为冬凌草甲素和冬凌草乙素。河南省济源市太行山区所产冬凌草中冬凌草甲素和冬凌草乙素的含量均显著高于其他产地冬凌草中的含量。是什么原因导致这种因产地不同所致的特异类型的存在，尚属研究空白。本项目对不同地理种群及种内变异类型冬凌草进行检测，结合冬凌草二萜类成分高效液相指纹图谱，分析冬凌草的遗传多样性和遗传结构，为冬凌草种内分类提供理论依据，并筛选出冬凌草甲素、乙素含量较高和不含（或含量较低）的植株。以冬凌草离体培养细胞和培养器官为研究体系，通过对冬凌草甲素、冬凌草乙素生物合成关键酶、调控基因以及培养条件等方面进行研究，分离鉴定调控基因，观察冬凌草甲素和冬凌草乙素生物合成、释放以及调控过程，从分子水平和细胞水平探讨生物合成和调控机理,为冬凌草规范化种植条件和冬凌草甲素和冬凌草乙素工业生产奠定理论基础。

本项目从伏牛山区、太行山区、横断山脉的贵州省等冬凌草主要分布区采集了样品。通过HPLC法测定，筛选出了冬凌草甲素、乙素含量高（DLC-G）和不含冬凌草甲素、乙素（DLC-D）的植株。建立了冬凌草二萜类成分的化学成分指纹图谱。利用RAPD和ISSR分子标记技术对23个冬凌草样品进行了遗传多样性和亲缘关系分析。.建立了冬凌草的离体培养体系，最优培养基为MS上附加6-BA0.1mg/L，NAA0.5mg/L，2,4-D1.0mg/L。以冬凌草（DLC-G、DLC-D）愈伤组织为材料研究结果表明，冬凌草悬浮细胞中不产生冬凌草甲素，添加前体物、刺激剂、抑制剂以及稀土元素均不能诱导细胞中冬凌草甲素的产生。但上述物质能诱导冬凌草乙素的产生和积累；其中ATP、AMP还能促进DLC-D细胞中冬凌草乙素的合成。而前体物叶绿素对冬凌草悬浮细胞生长及冬凌草乙素的累积影响不大。.分别提取冬凌草DLC-G、DLC-D样品的mRNA, 以mRNA为模板，研究得到cDNA文库。以cDNA文库作为转录组测序材料进行测序分析。DLC-G获得 50934276 reads，GC含量为48.06%；DLC-D获得61561674 reads，GC含量为48.13%。共获得44626条unigenes。对GLC-G、GLC-D差异基因的表达分析表明，DLC-G、DLC-D 2个样品共找到差异表达基因1298条，上调基因有339条，下调基因959条。.根据冬凌草二萜类物质合成代谢路径，分别选择DXR、IdI、ispf、isph、HMGS、AACT、DXS基因，设计克隆引物，做大肠杆菌克隆测序分析，获得了基因的序列数据。.分别采用Nr、Nt等数据库进行基因序列信息注释和分析。注释了DXR等基因的阅读匡、编码的蛋白质序列、蛋白分子量、等电点等信息。.采用荧光定量PCR方法，对以上获得7条基因以及通过转录组数据中获得KS、KO 、KAO基因在冬凌草不同部位的表达量进行了研究分析。发现每个基因在根、茎、叶的表达量有差异，在叶片中表达量相对较高，符合冬凌草二萜类有效成分主要在叶片中的研究发现。.分别对针对dxr、Idi、ispf、Isph基因设计原核表达引物，采用PET-28a载体、BL21感受态，做原核表达分析，通过IPTG诱导过夜后，做蛋白SDS-PAGE分析，诱导出了预期分子量大小的基因表达蛋白。