Dlk1在组织工程软骨形成过程中的作用及机制研究

Tissue engineered cartilage has potential applications in the treatment of cartilage defects. However, the maintenance of stable chondrocytic phenotype of seed cells has been the bottleneck. Dlk1 plays an important role in the determination of cell fate, and is also involved in the regulation of chondrogenesis, but its role in the regulation of chondrocytic phenotype remains to be elucidated. We found in our previous study that the expression level of Dlk1 was associated with the stability of chondrocytic phenotype and the tissue forming quality in tissue engineered cartilage. Therefore, in this study, we plan first to check the expression of Dlk1 in the native cartilage and analyze the biological characteristics of surface markers, proliferation, chondrocytic phenotype, and cartilage tissue-forming ability of the sorted Dlk1+/- subpopulations. Then, we will take engineered cartilage constructed with three different seed cells of mature chondrocytes, dedifferentiated chondrocytes, and bone marrow mesenchymal stem cells and PGA/PLA scaffold as the study models, to investigate the function and mechanism of Dlk1 in the regulation of chondrocytic phenotype by the approaches of Dlk1 gene overexpression and addition of exogenous FA1, which is the soluble active form of Dlk1. Finally, we will test the effect of Dlk1/FA1 intervention on the long-term in vivo stability of the chondrocytic phenotype of engineered cartilage. This study may help understand the function and mechanism of Dlk1 in the regulation of chondrocytic phenotype during tissue engineered cartilage formation process and provide us with a theoretical basis and an advanced technique proposal for constructing tissue engineered cartilage with stable chondrocytic phenotype.

组织工程软骨治疗软骨组织缺损具有良好的临床应用前景。如何维持软骨细胞表型的稳定性是构建组织工程软骨的瓶颈问题之一。文献报道Dlk1是一个决定细胞命运的关键基因，对软骨分化有重要调控作用，但具体的调节作用和机制尚不清楚。本课题组在前期研究中首次发现，组织工程软骨的软骨细胞表型稳定性及组织形成质量与Dlk1的表达水平有相关性。为进一步明确Dlk1在组织工程软骨形成过程中的作用及机制，本项目拟检测Dlk1在生理软骨中的表达及Dlk1阳性软骨细胞的生物学特性；以基于三类种子细胞和PGA/PLA材料构建的组织工程软骨为研究模型，检测Dlk1及软骨分化相关分子的动态表达，过表达、外源性添加Dlk1可溶性成分FA1分析Dlk1在组织工程软骨形成过程中的作用；进一步检测软骨分化关键转录因子及信号通路分子，探讨Dlk1维持软骨细胞表型稳定性的调控机制。本项目可为组织工程软骨的稳定构建提供理论基础与优化方案。

Dlk1（Delta-like1 Homologue）是Notch/Delta/Serrata家族的一个跨膜蛋白。研究发现Dlk1不仅与胚胎发育有关，并可决定出生后多种组织细胞（如脂肪、骨、软骨、造血、胰腺等细胞等）的分化命运。本项目对Dlk1在软骨中的特异性表达和作用机制进行研究，分为以下几个研究内容：1）Dlk1在胎儿和成人软骨及其他组织中的表达研究；2）Dlk1在不同代数软骨细胞中的作用研究；3）Dlk1在MSCs 2D诱导三向分化的过程中的表达和作用研究；4）Dlk1在BMSCs pellet成软骨诱导及组织工程软骨形成过程中的表达研究 5）残耳软骨和正常耳软骨的差异性研究及其与DLK1的关系研究。结果表明，1）Dlk1除了在胚胎期广泛表达外，在成人的软骨组织中也有特异性表达。而且，即使成人软骨组织相对胎儿软骨组织的分化程度更高，但由于Dlk1和干性相关基因OCT4A、NANOG、SOX2在成人耳软骨中的特异性高表达，我们推测软骨可能是成体组织中仍然相对幼稚的组织；2）软骨细胞在去分化的过程中Dlk1和干性相关基因的表达逐渐增高，可能提示其在体外培养的过程中更趋向前体细胞状态；3）单层培养条件下MSC的诱导分化与细胞真正的分化过程有一定区别，在我们建立的成体BMSC\ADSC三向2D分化模型中却未见Dlk1的动态表达；4）MSC在2D诱导环境下的分化程度相对低下，Dlk1检测不到；相反，在pellet诱导水平，Dlk1随着软骨形成发生了明显的动态表达变化；并且，在组织工程软骨植入体内后进一步的成熟及重塑阶段，Dlk1的表达出现了显著而迅速的上调。因此，我们发现随着在2D、pellet和带有支架的3D模型中软骨分化程度的提升，Dlk1的表达水平也相应增高。除了COL2、AGG等公认可以用来鉴定、评估软骨分化程度的指标外，Dlk1 可能可以作为鉴定软骨分化成熟度的新指标，也可以作为成功构建组织工程软骨的评价标准之一；5）在组织工程软骨形成过程中，Dlk1基因的表达趋势和其他软骨相关基因Col II, Acan等不同，后者存在先增高后降低的趋势，在体内构建3周时有表达高峰，而Dlk1的表达是随着组织工程在体内发育成熟过程表达逐渐升高的，尤其在正常耳软骨构建的工程化软骨中的表达较同时期的残耳软骨组显著增强，这进一步证实了Dlk1作为鉴定组织工程软骨分化成熟度的标志。