冬凌草甲素诱导前列腺癌细胞凋亡过程中microRNA作用的研究

部分microRNA(miRNA)在雄激素非依赖性前列腺癌（androgen-independent prostate cancer，AIPC）的形成过程中发挥重要作用,可以成为治疗前列腺癌的良好靶标。萜类化合物具有良好的抗肿瘤作用，一种单体双萜类化合物-多烯紫杉醇化疗是治疗转移性AIPC的标准方法。但是多烯紫杉醇化疗的效果一般，因此迫切需要发现治疗AIPC的新药物。前期研究中我们发现AIPC中miRNA146b表达下调，其可能成为AIPC治疗的靶标。同时我们发现一种萜类化合物冬凌草甲素可以诱导前列腺癌细胞凋亡，同时伴随miRNA146b表达增加。但miRNA146b在冬凌草甲素诱导前列腺癌凋亡中是否发挥作用？发挥何种作用？本课题通过研究拟揭示miRNA146b在冬凌草甲素诱导前列腺癌凋亡中的作用及其调节的信号转导通路，为针对AIPC形成机制采用药物干预治疗AIPC提供新思路和新方法。

我们首先研究了冬凌草甲素诱导前列腺癌细胞凋亡的通路。我们发现50μM冬凌草甲素作用LNCaP和LNCaP-AI细胞72 h后诱导前列腺癌细胞凋亡，并且激活前列腺癌中的caspase-3和caspase-9,但未激活caspase-8。而特异性caspase-9抑制剂可以抑制冬凌草甲素诱导的前列腺癌细胞凋亡。这表明冬凌草甲素通过激活内源性凋亡通路引起前列腺癌细胞凋亡。我们进一步研究了miRNA在冬凌草甲素诱导前列腺癌凋亡过程中的作用。我们应用实时定量PCR检测发现冬凌草甲素作用前列腺癌细胞72 h后miRNA-146b表达增加。miRNA-146b模拟剂促进冬凌草甲素引起的细胞凋亡并促进其引起的caspase-9,3的激活。而miRNA-146b抑制剂可以明显抑制冬凌草甲素引起的凋亡作用并抑制其引起的caspase-9,3的激活。这表明冬凌草甲素通过促进miRNA-146b的表达诱导前列腺癌细胞凋亡。我们进一步研究了miRNA-146b调控的下游通路在冬凌草甲素诱导前列腺癌细胞凋亡中的作用。我们发现50μM冬凌草甲素作用于前列腺癌细胞72 h后TRAF6的表达，但IRAK1、EGFR和CRCX4的表达没有变化。miRNA-146b模拟剂增强冬凌草甲素对TRAF6表达的抑制作用，而miRNA-146b抑制剂则可以拮抗冬凌草甲素对TRAF6表达的抑制作用。在LNCaP和LNCaP-AI细胞中过表达TRAF6，则可以拮抗冬凌草甲素诱导的细胞凋亡。同时冬凌草甲素降低了前列腺癌细胞中磷酸化IκBα的表达，但其对IκBα和p65的表达没有影响。miRNA146b抑制剂拮抗冬凌草甲素引起的磷酸化IκBα表达降低，而miRNA146b模拟体促进冬凌草甲素引起的磷酸化IκBα表达降低。在LNCaP和LNCaP-AI细胞中转染shRNA p65 48 h后,可以抑制p65表达，但不能抑制冬凌草甲素引起的miRNA-146b表达增加。上述结果表明冬凌草甲素促进miRNA-146b的表达，进而抑制TRAF6的表达，进一步抑制NF-κB的激活，诱导前列腺癌细胞凋亡。在去势抵抗性前列腺癌形成过程中miRNA表达变化发挥重要作用，我们应用冬凌草甲素逆转了去势抵抗性前列腺癌中miRNA-146b降低的现象，进而诱导了前列腺癌细胞的凋亡，为去势抵抗性前列腺癌的治疗提供了新思路和新方法。