牛肌肉发育过程中lncRNAs及其靶标蛋白功能研究

LncRNAs are a class of lowly conserved, long non-coding RNAs that emerge as a key regulator involved in multiple cellular processes by various ways. Our previous study revealed many lncRNAs expressed differently among different developmental stages of bovine muscle by lncRNA-seq. In this study, we will identify the major lncRNAs in cattle myogenesis by bioinformatics analysis and q-PCR and then construct gain of function and dysfunctional cell model in order to investigate the effect of lncRNAs on the proliferation and differentiation of bovine myoblasts. Furthermore, RNA pull-down trail and mass-spectrometric analysis will be carried out to recognize lncRNA’s potential target protein and determine the relationship between them. Integration of all results, we will systematically elucidate the roles of lncRNAs and their target protein play in bovine muscle development.

lncRNAs是一类种间保守性相对较低的长链非编码RNA，作为生物体内重要的调节因子，可以通过多种途径参与机体的各类生命活动。在前期研究中，本实验室利用lncRNAs深度测序对牛不同生长发育阶段肌肉组织中的lncRNAs进行检测，获得多个差异表达lncRNAs。本项目拟在此基础上，利用生物信息学分析及q-PCR方法鉴定牛肌肉发生过程中的关键lncRNAs，通过构建牛成肌细胞lncRNAs过表达和功能缺失模型，验证lncRNAs对牛肌肉细胞增殖和分化的影响，并利用RNA pull-down 和质谱技术获取并辨别lncRNAs的互作蛋白，研究 lncRNAs与其靶标蛋白的作用模式，阐明其调控通路，系统分析牛肌肉发育过程中关键lncRNAs及其靶标蛋白功能。

lncRNA作为一种主要的转录调控因子，在生物体的生长发育、疫病发生、系统生成、生理代谢等多种生命活动中具有及其重要的作用。本项目主要开展了肌肉发育相关lncRNA的筛选与鉴定工作，通过对前期3个不同时期RNA-seq数据的系统分析，获得不同时期差异表达mRNA 3079条，lncRNAs 9913条，miRNA 779条，并分析了他们的表达特征、分布特征及结构特征，用以佐证其潜在功能。依据lncRNA可能通过调控其临近基因的表达进而发挥其转录后水平调节功能的作用机制，项目组采用生物信息学技术对lncRNAs的靶基因进行预测与分析，发现差异基因中有650条lncRNAs与590条mRNA之间存在863条潜在的调控关系，并通过GO和KEGG分析筛选出90条lncRNA与69条mRNA及其潜在的互作关系可能与肌肉发育密切相关。.鉴于此，项目组对其中2条lncRNAs, lnc957和lnc403进行了深入研究，成功构建了lnc957和lnc403的干扰及过表达成肌细胞模型，并验证其在肌细胞增殖和分化过程中的功能及可能的作用机制。结果显示lnc957对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化具有促进作用，同时，lnc957可以靶向调控KBTBD10基因的表达，暗示lnc957可能通过调控下游靶基因KBTBD10进而调控牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程。在对lnc403研究中，我们利用RACE技术获得了lnc403的全长序列共2607bp，并且发现lnc403的表达变化对成肌细胞增殖没有显著影响，但对成肌细胞分化具有明显的抑制作用。通过pull down实验发现，在成肌细胞增殖过程中与lnc403直接结合的蛋白共有436个，其中同时直接与细胞增殖和肌动蛋白相关的蛋白有5个。我们对其中与细胞增殖分化密切相关的KRAS靶蛋白进行分析，发现lnc403表达量上调或下调均会导致KRAS mRNA和蛋白水平表达受到抑制，说明lnc403可能通过结合并调控KRAS的表达影响成肌细胞的分化。.综上，本项目主要鉴定出可能与肌肉发育密切相关的90条lncRNAs，为深入开展lncRNA对肌肉发育作用研究提供了较为可靠地候选靶点。同时，实验验证了lnc957和lnc403在肌细胞增殖和分化过程中的功能及作用机制，为加深对肌肉发育机理的了解与认识，完善肌肉发育过程的调控网络提供一定的理论支持。