牛肌肉发育分化过程中关键lncRNA功能及其调控机制研究

It is vitally important to investigate the molecular and regulation mechanism in muscle development for beef cattle breeding. The lastest research verified that the lncRNA, a kind of major biological regulators, associated with the myogenesis closely. Currently，function studies of lncRNA is still in initial stage, and lncRNA’s complex mechanism and poor sequence conservation inter-species result in little reference value among different species. Therefore, further studied of key lncRNA function in myogenesis is urgently necessary. In the previous study, the applicant has completed the lncRNA-seq and analysis in different growth stage muscle of bovine. In this study, we will construct gain of function and dysfunctional bovine myoblasts model basing on the key lncRNA, and carry out the further research by Microarray, RNA pull down etc.in order to (1) get key lncRNA in myogenesis, (2) determine the interaction between lncRNA and target factor (mRNA, miRNA and protein), (3) analyzes the function of key lncRNA in the transcriptional, post-transcriptional and protein levels.

深入了解肌肉发生机理和调控机制对培育高产优质肉牛品种具有重要科学意义，最新研究表明lncRNA作为重要的生物调控因子与肌肉发生密切相关。目前，lncRNA的功能研究仍处于起步阶段，而且其作用机制复杂，物种间序列保守性差，致使不同物种间研究结果的参考价值有限，因此，牛肌肉发生相关lncRNA的功能亟需进行深入研究。在前期研究中申请人已完成了牛不同生长发育时期肌肉组织的lncRNA深度测序及分析工作，本项目以前期研究获得与牛肌肉发育密切相关的lncRNA为基础，分别构建功能获得性和缺失性牛成肌细胞模型，利用基因芯片、RNA pull down 等技术开展深入研究：①获得牛肌肉发生关键的lncRNA；②解析肌肉发生过程中关键lncRNA与其靶标mRNA、miRNA和互作蛋白的作用模式；③综合各项结果，系统分析关键lncRNA在转录水平、转录后水平和蛋白水平对牛肌肉发生的调控作用。

肌肉的生长发育受到基因调控网络的精细调控。而lncRNA作为一种重要的生物调控因子，在多种生命活动中具有重要作用。本项目深入分析了前期获得的3个不同时期的肌肉样品RNA-seq数据和多种非肌肉组织的DEG数据，筛选并验证了10条与肌肉发生密切相关的lncRNA，并对其中的lncKBTBD10、lnc23、lncYYW进行了深入的功能验证和调控机制研究。为探究牛肌肉生长发育机制打下良好基础，在培育肉牛新品种，改善牛肉产量及品质的道路上起到积极推进作用。.主要结果总结如下：.1、lnc23、lncYYW、lncKBTBD10等3条lncRNAs对牛成肌细胞的增殖和分化具有调控作用。.2、lncKBTBD10可抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖和分化进程，并可调控其临近基因KBTBD10的蛋白质表达水平。初步证实了lncKBTBD10可通过下调KBTBD10蛋白表达影响牛骨骼肌卫星细胞的分化过程。.3、在lnc23的研究中，利用蛋白组学和RNA pulldown/LC-MS技术获得140个lnc23的潜在结合蛋白，并利用RIP技术获得lnc23的结合靶标蛋白PFN1，初步证实lnc23能以与PFN1直接结合的方式促进small GTPase Rho家族成员RhoA和Rac1的表达进而正调控成肌分化过程。此外，利用RNA测序技术筛选lnc23抑制表达模型中的差异RNAs，分别获得115个差异miRNAs和1297个mRNA。经系统的功能验证后证实miR135a是lnc23的功能靶标，若miR135a表达下调可显著促进其下游靶基因MEOX1的表达，进而抑制骨骼肌卫星细胞的分化，揭示了lnc23可通过miR135a/MEOX1途径调控牛骨骼肌卫星细胞分化的分子机制。.4、在lncYYW的研究中，通过RACE技术获得其732bp的全长序列，并成功构建了lncYYW的过表达模型，发现其可负调控牛骨骼肌卫星细胞的分化过程，通过小RNA测序和qRT-PCR技术筛选并验证了lncYYW潜在互作的靶标因子miR1。深入研究发现，过表达lncYYW后，miR1的靶基因SFRP1和SRSF9有显著上调的趋势。而参与细胞骨架通路中miR-1的靶基因FN1和miR-1预测的靶基因ITGB3在mRNA水平显著下调，提示lncYYW可能通过下调miR-1靶基因的表达抑制牛骨骼肌卫星细胞分化。