秦川牛肌肉发育相关miRNA鉴定与功能研究

MiRNAs are about 18 ～ 24nt single-stranded non-coding RNA molecules, which play an important role in animal growth, development, hormone secretion, occurrence of diseases, and other life activities on a post-transcriptional regulation way. Muscle growth and development are the most important economic traits in beef cattle. Therefore, the aims of this project are as follows: (1) to build Qinchuan cattle muscle tissue miRNAs libraries at different developmental stages using the new generation high-throughput sequencing technology and to screen significantly different miRNAs that are expressed among different development stages; (2)to identify the miRNA expression patterns of different developmental stages by q-PCR technology; (3) to predict and verify target genes of the miRNAs using bioinformatics method and dual fluorescence report experiment; (4) to clarify the biological regulation mechanism of key miRNAs by miRNA over-expression,interference strategies and other modern biotechnologies in RNA, proteins and cellular levels; (5) to reveal the associations between the key miRNAs base mutation and growth devolopment, meat quality traits in Qinchuan cattle by detection SNP of miRNAs and association analysis. We hope all these would indicate molecuar regulation mechanisms of the key miRNAs in the process of muscle development, provide a new theoretical basis for Qinchuan beef breeding and efficient production of excellent quality beef, a new idea for research of transgenec beef cattle.

miRNA作为一类来自生物体自身非编码长度约为18～24nt的单链小分子RNA，参与动物基因转录后表达调控，在动物生长、发育、激素分泌及疾病发生等生命活动中均起到极其重要作用。肌肉生长发育是肉牛最重要的经济性状。因此，本项目以秦川牛为研究对象，利用新一代高通量测序技术构建秦川牛肌肉组织miRNA文库，经生物信息学分析获得肌肉组织中miRNA的基本特征，筛选出不同发育时期肌肉组织表达差异显著的miRNA；利用qPCR技术验证其不同发育时期的表达规律；通过双荧光报告试验揭示候选miRNA的靶基因；利用miRNA超表达和干扰策略从RNA、蛋白质和细胞水平系统研究候选miRNA的生物学功能，阐明关键miRNA在肌肉发育过程中的分子调控机制；研究miRNA的碱基突变，揭示其对秦川牛生长和肉质性状的影响。为秦川牛肉用选育和牛肉优质高效生产提供新的理论依据及为转基因肉牛研究提供新的思路。

本课题以脂肪组织作为参考，以秦川牛肌肉作为主要研究实验对象，对不同发育时期的肌肉和脂肪组织miRNA进行鉴定和分析，并结合肌肉分化、脂肪细胞分化过程中lncRNA的变化，运用生物信息学和多种分子生物学手段对miRNA在肌肉和脂肪发育过程中的分子机制进行了深入阐释。通过对秦川牛胚胎期90天和200天、出生后5日龄犊牛、12月龄青年牛及24月龄成年牛背部肌肉组织小RNA的比较分析，共鉴定出510条成熟的miRNAs，预测得到125条新miRNAs。秦川牛胎牛期和成年期背部脂肪组织小RNA的比较分析显示出475个成熟miRNAs。通过对不同时期miRNA表达分析发现了大量差异表达miRNA，为后续分析提供材料。miRNA片段保守长度通常为22 nt，首位碱基偏向于U，第10号位碱基主要为A，种子区碱基一般缺少U，在3'端和5'端普遍存在不同程度的变异。分别对肌肉和脂肪发育不同时期的差异miRNA进行了靶基因预测和功能分析。秦川牛出生前后肌肉组织的36个差异表达miRNA的3069靶基因主要参与参与肌肉生长发育相关的多种生理和病理调控过程。对肌肉和脂肪组织miRNA比较分析发现，脂肪组织显著高表达的miRNAn25和miRNAn26靶基因中分别有126个和44个靶基因与脂肪形成或脂滴沉积等过程显著相关；肌肉组织特异性表达且在出生后肌肉组织中显著高表达的miR-10020有27个靶基因与肌肉组织生长发育密切相关。通过双荧光素报告系统、过表达或敲低等方法对bta-miR-10020、miR-30-5p、MiR-181a、miR-101-1、miR-181a、miR-208b靶基因进行验证，并深入的分析了miRNA与靶基因之间的关系，构建了其调控网络。此外，本课题深入探讨了长链非编码RNA lncRNA MD与miR-125b调控牛肌肉分化的机制，发现lncRNA ADNCR通过竞争性结合miR-204抑制牛脂肪细胞分化。本项目共在BBA-Molecular Cell Research，Scientific Reports，RNA biology，Journal of Functional Foods，Journal of Animal Science，BMC genomics等杂志发表SCI论文17篇，其中，IF>5.0的SCI论文5篇，获3件授权国家发明专利及1件软件著作权。