新型微流控神经血管单元模型构建及用于LRP1介导Aβ转运机制的研究

Brain Amyloid-β (Aβ)level and aggregation degree is closely related to Alzheimer's disease. As the basic structural and functional units of the nervous system, comprehensive study research on the neurovascular unit (NVU) is help to clarify the machanism of Aβ transport mediated by low density lipoprotein receptor related protein 1 (LRP1). Present NVU models is not good at control the cellular microenvironment, so it is need to constructe a novel in vitro model which easy controllable and close to the cell urvival microenvironment. Microfluidic chip provide multidimensional network microchannel to achieve precise control of the culture system and simulate the microenvironment of the cells in various physiological or pathological state. Polydimethylsiloxane (PDMS), the material of microfluidic chip allows sufficient gas exchange for biological cells to be cultured in microchannels for extended periods. Also we can on-chip real-time monitor and analysis of results during cell growth process. Based on our previous studies, in this research we use microfluidic chip to constructe a novel NVU model, integrated with structure-physical- chemical and biological factors. Combined with active perfusion of micro-channeland gel passive diffusion to precisely regulated the NVU microenvironment in time and space. Then we identified and evaluate the model and use this model to study the machanism of Aβ transport mediated LRP1. Our research provides a new way for prevent and treatment of AD disease.

脑中Aβ水平及其聚集程度与AD密切相关，以神经系统结构和功能单位神经血管单元（NVU）整体研究更利于阐明LRP1介导的Aβ转运机制。目前NVU模型不能很好地调控细胞微环境，需构建容易控制的、接近在体微环境条件的NVU体外模型。微流控芯片的多维网络通道能实现对培养体系的精确控制，相对精确地模拟细胞在生理或病理状态下的各种微环境，微流控芯片材料PDMS能保证细胞培养过程中气体的交换，还可对细胞生长过程进行实时监控和结果分析，能实现对三维微环境的构建。我们在前期研究基础上，利用微流控芯片系统，整合构型-物理-生物化学的因素，采用由两套流路系统控制的多层微流控细胞培养组件，结合微通道主动灌流与凝胶中的被动扩散，实现对NVU微环境在时间和空间上的精确调控，构建新型NVU体外模型，并对此模型进行评价和鉴定，并进一步探讨LRP1介导的Aβ转运机制及对NVU的影响，为多靶点、多角度防治AD提供新的思路。

脑中β-淀粉样蛋白(Aβ)水平及其聚集程度与阿尔茨海默病(AD) 密切相关，以神经系统结构和功能单位神经血管单元(NVU)整体研究更利于阐明低密度脂蛋白受体相关蛋白-1 (LRP1)介导的Aβ转运机制。目前NVU模型不能很好地调控细胞微环境，需构建容易控制、接近在体微环境条件的NVU体外模型。研究利用多层微流控细胞培养组件设计构建NVU模型的血管端和神经端，通过微通道主动灌流方式控制细胞生存环境，模拟体内物质运输形式，实现细胞与细胞之间及细胞与外界的物质交换。采用SU-8光刻技术制备硅片阳模，模塑法制备PDMS芯片，高真空氧等离子体技术进行键合，连接流体控制系统，构建微流控芯片系统。根据三细胞和两细胞共培养方案，依次引入分离培养的神经元细胞、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞进行共培养，建立NVU体外模型。对模型进行鉴定，激光共聚焦显微镜观察显示共培养细胞在模型中生长良好，能表达相关细胞特异性抗原。免疫荧光检测显示在内皮细胞之间ZO-1和occludin表达非常明显，表明已经建立紧密连接。原位包埋法透射电镜观察观察到模型内皮细胞侧的紧密连接蛋白形成且具有较高密度。荧光素钠通透性实验显示屏障形成良好，能够较好的限制荧光素钠通透性。跨膜电阻(TEER)结果显示模型可形成较高的跨内皮电阻，尤其以共培养五天达到峰值，其TEER均值在201Ω•cm2，此后一直到第九天都维持在较高水平，而单层脑微血管内皮细胞组培养五天TEER均值为137Ω•cm2。以上结果表明我们建立的微流控芯片模型的紧密连接形成好，有较强的屏障作用，是一个较好的NVU体外模型。利用构建模型观察外源性Aβ1-40转运情况，显示当在胶质细胞侧加入Aβ1-40时，由于外流转运的结果，其浓度逐渐降低，生理状态下20min时Aβ1-40浓度可降低到1/2，120min时降低到1/4。经过抗LRP-1处理后，Aβ1-40外流转运速度降低。而在内皮细胞侧加入凝溶胶蛋白可以加速Aβ1-40外流转运。本实验利用微流控芯片构建NVU模型，其结构完整，功能良好，且易于实现对NVU微环境的调控，此模型有望成为一个新的平台应用于药物筛选、神经系统基础等多项研究中。