tPA及LRP1对缺血脑组织神经血管单元的作用及机制研究

组织型纤溶酶原激活剂（tPA）是迄今为止唯一一个被美国FDA批准用于治疗急性缺血性脑卒中的溶栓药物。但研究表明tPA除具有有益的溶栓功能外，还可以作为细胞因子在脑缺血病理生理中发挥不利作用，目前机制不清。我们前期研究发现脑缺血再灌后，tPA通过其受体低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP1）可引起Akt的磷酸化，这可能与tPA引起的血脑屏障通透性增加有关，而血脑屏障是脑组织神经血管单元（NVU）的一个核心结构,其改变最终将导致NVU的结构、功能破坏。本课题旨在已往工作基础上，利用免疫印迹、Real-time PCR、激光共聚焦、EMSA等方法研究脑缺血后tPA与其受体LRP1相互作用激活PI-3K/Akt通路的分子机制，并探讨该信号通路在缺血脑组织神经血管单元中的作用以及相应的机制，为脑组织神经血管单元的分子调节机制提出新的见解，为tPA的合理应用提供理论依据，并为今后脑缺血的治疗提供新的思路。

tPA是目前唯一被美国FDA批准用于急性脑缺血的溶栓药物。但研究表明tPA除具有有益的溶栓功能外，还作为细胞因子在脑缺血中发挥不利作用。我们前期研究发现脑缺血后，tPA通过其受体LRP1可引起血脑屏障（BBB）通透性增加，最终将导致神经血管单元（NVU）的结构、功能破坏。本课题在已往工作基础上，进一步研究脑缺血后tPA-LRP1及其下游蛋白形成的信号通路，并探讨了该通路在NVU中的作用及相应机制。.我们发现，tPA与LRP1结合后激活了PI-3K/Akt，而pAkt表达增加与脑缺血后NVU通透性增加有关。我们给大脑中动脉阻断的野生型小鼠脑室内注射PI-3K-Akt/ Akt的特异性阻断剂Wortmannin。6小时后检查伊文斯蓝外渗率，以此显示BBB通透性。与对照组相比，Wortmannin组小鼠伊文斯蓝渗透率降低了57％+/-18％ 。.我们对大脑中动脉阻塞1小时后野生型小鼠和tPA基因敲除小鼠的脑组织提取物进行了免疫共沉淀的研究。结果表明，与野生型小鼠相比，tPA基因敲除小鼠及注射了受体相关蛋白RAP（LRP1受体阻断剂）的野生型小鼠，脑缺血引起的LRP1与pAkt相互作用明显减少。电镜结果显示LRP1胞内段(LRP-ICD)和pAkt共同存在于NVU的周围星形胶质细胞中。这些结果表明，在脑缺血的早期阶段，在血管周围的星形胶质细胞中tPA与LRP1的相互作用诱导Akt蛋白磷酸化。.NF-κB是pAkt的下游蛋白之一，我们将培养的野生型星形胶质细胞分两组，均暴露于氧糖剥夺状态，一组培养液中加入tPA, 另一组加入tPA及wortmannin, 然后通过免疫印迹分析p65（NF-κB的活化形式）的磷酸化水平。结果表明，tPA诱导了p65的磷酸化，而同时加入tPA和wortmannin，这一作用被明显抑制。因此，pAkt介导了tPA对NF-κB活化。.我们利用明胶酶谱法测定wortmannin处理组及非处理组野生型小鼠缺血脑组织提取物中MMP-9活性。结果显示Wortmannin组，缺血脑组织中MMP-9的活性明显降低。因此，tPA-LRP1-pAkt通路引起血脑屏障通透性增加与MMP-9激活有关。.总之，在脑缺血早期tPA和LRP1在NVU的星形胶质细胞中的相互作用激活pAkt介导的细胞信号通路，引起星形胶质细胞终足与管周基膜分离，最终导致BBB通透性增加