分泌型miRNA介导的血小板功能重塑在肝癌血行转移中的机制研究

Tumor metastasis is the main factor that affects the prognosis of patients with hepatocellular carcinoma. Increasing evidence suggest that the abnormal activation of platelets promotes metastasis of hepatocellular carcinoma. Recently, it is found that expression change of miRNAs in platelet affect platelet’s function, and promote immune escape and vascular colonization of HCC cells. As a fragmentation without genomic DNA, the mechanism of regulating miRNA levels in platelet is still unknown. We therefore hypothesis that platelet might receive exsomal miRNA secreted by tumor cells, and ultimately participate in the metastasis of hepatocellular carcinoma cells. In this project, to test our hypothesis, we plan to: (1) identify HCC cell derived miRNA; (2) confirm that HCC derived miRNA can be transferred to platelets and regulate platelet function; (3) investigate the role of platelet functional remodeling in immune escape and vascular colonization of HCC cells. This project will further reveal the secreting type miRNA mediated "HCC - platelet" mechanism, and provide potential biomarkers of early diagnosis and new therapeutic strategies for HCC patients.

肿瘤转移是制约肝癌患者预后的主要因素。大量线索表明，肝癌患者体内异常活化的血小板能够辅助肝癌细胞远处转移。课题组前期发现，血小板内miRNAs水平变化能够影响血小板功能重塑并参与肝癌细胞免疫逃逸及血管定植。血小板作为缺乏基因组DNA的无核碎片，如何实现其内miRNAs表达水平变化？是否受到自身以外影响？目前尚无研究。基于前期基础，课题组提出：肝癌细胞分泌的miRNA可以以外泌体为载体，通过影响血小板内源性miRNA水平调控血小板功能，最终参与肝癌细胞转移。本项目拟：鉴定肝癌细胞源性miRNA并明确其与血小板作用形式；证明分泌型miRNA能够递送给血小板调控血小板功能重塑；阐明功能重塑的血小板介导肝癌细胞免疫逃逸及血管定植的分子机制。本项目完成将进一步揭示分泌型miRNA介导的“肝癌细胞-血小板”通讯机制，为建立肝癌早期监测及治疗的新策略提供思路。

肝癌转移是影响肝癌患者预后的重要因素之一。项目组前期发现血小板内的miRNA在肝癌细胞转移过程中发挥重要作用，但是对于这些血小板发生功能转化的原因尚不清除。基于这一问题，本项目证明了肝癌细胞源性的miRNA可由外泌体递送至血小板内部并引起其功能重塑，促进其对肿瘤细胞EMT表型转化、免疫逃逸等转移相关表型的辅助作用。在本研究中，我们首先对肝癌细胞源性的外泌体miRNA进行鉴定和初步筛选，并通过病人样本验证了肝癌细胞源性的外泌体miRNA对于肝癌病人预后的预测价值。与此同时，我们在明确了血小板摄取肝癌细胞源性miRNA过程的基础上研究了miRNA对于血小板功能重塑、活化以及颗粒分泌的影响。接着，我们通过生物信息学预测结合实验筛选了5种关键miRNA，并对其中miR-4634进行了体外实验的功能验证。在对于miR-4634的靶点探索中，我们发现并通过实验验证了其对MAOA和MAOB的mRNA稳定性的维持作用，并在体外细胞层面证明了这一机制。进一步，我们研究证明了肝癌细胞源性的miRNA介导的血小板功能重塑是通过激活其细胞内TGFB1和PKC-AKT通路而完成。最后，我们制备了利用肝癌细胞源性miRNA活化的血小板，并利用这些功能重塑的血小板干预了肝癌细胞证明了其对肝癌细胞EMT标志物的促表达作用、对细胞凋亡的抑制作用、对于细胞增殖的促进作用和对化疗药物耐药的促进作用。在肝癌细胞免疫逃逸及血行转移的表型研究方面，我们证明了功能重塑的血小板对于肝癌细胞逃避NK细胞杀伤的作用，以及其介导的MHC-I、Fas-L等肿瘤免疫相关标志物的负性调控作用。本研究在既往研究的基础上进一步阐释了肝癌促进血小板功能重塑的现象，揭示了肝癌细胞以外泌体为载体，向血小板输送miRNA并促使其发生功能状态的改变；这些血小板有在肝癌的血行转移和发展中发挥着重要作用，有望成为未来遏制肝癌转移的治疗靶点。