压力调控BMSCs/PRF双膜结构修复髁突软骨缺损的实验研究

髁突软骨缺损是亟待解决的临床难题，基于骨髓间充质干细胞（BMSCs）设计的组织工程化软骨为髁突软骨缺损的再生修复带来了新的希望。研究力学和基质微环境下BMSCs向成软骨细胞分化的调控及机理对于再生软骨质量的控制具有重要意义。本项目拟以经髁突软骨细胞共培养诱导的膜片化BMSCs，复合富含多种内源性生长因子的富血小板纤维蛋白（PRF），构建BMSCs/PRF双膜复合体，模拟关节软骨再生的基质微环境。在此基础上，研究适宜压力刺激下BMSC软骨向分化的力学生物学响应，探索BMSCs用于关节软骨再生时的力学信号转导机制。并通过将压力微环境预调的BMSCs/PRF双膜复合体用于动物髁突软骨的缺损修复，揭示功能性力学刺激与髁突软骨再生之间的量效关系。研究结果将为体内组织工程关节软骨的力学环境控制提供实验依据；为髁突软骨缺损性疾病的治疗乃至多种关节软骨缺损的体外组织工程设计提供新的思路和研究经验。

由外伤、骨关节炎等导致的关节软骨损伤是临床常见疾病之一，但软骨因缺乏血管及神经支配，其再生能力非常有限，因此，寻找一种能有效修复软骨缺损的方法就显得尤为重要。本课题组创立了一种干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜双膜复合体移植材料的制备方法，将自体BMSCs膜片与PRF复合形成BMSCs/PRF双膜复合体，采用液压加载系统对BMSCs/PRF双膜复合体分别给予90 KPa、120 KPa、150 KPa静压每天加载1 h或6 h，实验2、4、6 d时取材。实时定量PCR检测BMSCs成软骨相关基因Sox-9，Aggrecan，Col-Ⅱ以及细胞增殖基因PCNA mRNA的相对表达量，从中筛选出既能促进细胞增殖又能促进其成软骨分化的120 KPa每天60min，连续4天的静态液压作为最佳压力刺激条件。然后，我们将兔自体BMSCs与PRF复合成双膜结构复合体以该最适力学刺激条件调适后，分别进行裸鼠皮下异位移植与兔TMJ髁突软骨缺损区原位移植，2、4、8周取材，组织学分析及弹性模量检测均证实以压力预调的双膜复合体移植组软骨修复与再生效果最显著，在8周时可达到缺损完全修复、且新生软骨与周围残余正常软骨组织的良好整合，再生软骨的弹性模量可达到正常软骨的75%左右。BrdU染色结果证实新生软骨组织主要来源于外源性植入的BMSCs。至此，我们证实BMSCs/PRF所构建的双膜复合体结构是一种理想的髁突软骨缺损的组织工程移植物；压力预调对基于BMSCs/PRF双膜结构的髁突软骨缺损再生修复过程具有明显的促进作用。本项目还进一步从细胞力学角度研究了NF-κB、Wnt以及BMP信号通路在压力促BMSCs/PRF成软骨的力学信号转机制，发现NF-κB/p38信号通路、Wnt/β-catenin信号通路以及BMP/Smad通路在上述压力预调促下颌髁突软骨再生修复过程中起到重要的正向调控作用。活体阻断研究结果证实NF-κB抑制剂PDTC阻断BMSCs中NF-κB信号通路后再用压力预调的BMSCs/PRF双膜结构移植填充缺损区，关节软骨再生修复效果在软骨细胞数量、软骨基质含量、新生软骨与余留软骨的整合性乃至再生软骨的生物力学性能等多方面均明显降低，从而证明细胞力学所验证的力学信号转导机制的可靠性及与体内研究的一致性。本研究结果将为髁突软骨缺损性疾病的治疗和多种关节软骨缺损再生修复提供新的契机。