一种新的力学敏感分子ANTXR1在压力促BMSCs成软骨响应中的作用及力学信号转导机制研究

Our previous studies found that presetting BMSCs with hydrolic pressure could maximize the chondrogenic potential of BMSCs, and thus significantly improve the quality and quantity of the regenerated mandibular condylar cartilage, but how the BMSCs membrane feel and initialize the mechanotransduction process still keeps unknown. As a type I transmembrane protein, ANTXR1 was found highly expressed in BMSCs under hydrolic pressure. However, the effects and down-streaming mechanotransduction pathways were still not clear. The present project intends to reveal the exact role and signal transduction pathways of ANTXR1 in the mechanically promoting chondrogenesis process of BMSCs from both in vitro and in vivo aspects by utilization of RNAi, gene transfection, specific signal transduction pathway detections. We expect it can help to further explore the mechanical signal transduction mechanisms of the stem cells. We believe this research work will contribute to revealing the nature of in vivo mechano-environment for BMSCs, and to providing more specific and effective molecular targets for development of new strategy for articular cartilage defect repair and regeneration.

本项目组前期研究发现压力预调可使BMSCs的成软骨潜能得以最大限度的发挥从而显著提高再生髁突软骨的质与量，但对于BMSCs究竟是如何在细胞膜水平感受力学刺激并初始化力学信号转导的过程仍并不清楚。ANTXR1作为一种I型跨膜蛋白，被本项目组前期SILAC差异蛋白质组学研究发现在受到压力刺激后的BMSCs中异常高表达。而到目前为止，国内外对于ANTXR1在力学信号感受中的作用及其相关分子机制目前国内外尚属空白。本项目拟综合利用RNAi、基因转染、特异性信号转导通路正向检测与逆向阻断等技术系统从体内外两方面揭示ANTXR1 在压力促BMSCs成软骨分化及髁突软骨组织工程修复过程中所发挥的作用及其信号转导机制。从一个全新的角度挖掘干细胞力学信号转导的机制，以期进一步揭示BMSCs体内应力微环境的生物学本质，并为开发力学可控性组织工程关节软骨缺损修复新策略提供更特异、更有效的作用靶点。

本研究在前期SILAC实验工作基础上，以ANTXR1的作用、功能以及信号转导研究为突破口，综合利用细胞膜片技术、慢病毒转染、特异性信号通路转导逆向阻断技术、免疫共沉淀、免疫荧光共定位及建立颞下颌关节髁突软骨缺损模型等技术为主，从体内体外两方面揭示ANTXR1在压力促BMSCs细胞膜片成软骨分化的信号转导机制及其在髁突软骨组织工程修复过程中所发挥的作用。研究者采用细胞膜片技术制备出含有大量细胞外基质及一定机械性的BMSCs细胞膜片，通过自主研发的多功能细胞正负压加载装置对BMSCs细胞膜片加以压力刺激，发现ANTXR1、Integrinβ1以及成软骨指标在120 kPa加压1h的力学环境下显著提升。采用慢病毒技术下调ANTXR1或下调Integrinβ1，发现ANTXR1同经典力学信号转导分子Integrinβ1一样，在压力促BMSCs细胞膜片成软骨响应中起重要作用。通过特异性信号通路转导逆向阻断技术、免疫共沉淀、免疫荧光共定位等技术，发现BMSCs中ANTXR1与Integrinβ1这两个膜信号感受分子存在一定程度的共定位关系，但二者各自独立地对力学信号进行转导和响应；LRP5/6、GSK3β/β-Catenin、F-actin/Fscn1以及TGF-β/Smad2/Smad4可能是ANTXR1的下游通路。体内实验结果显示，下调ANTXR1后的BMSCs细胞膜片无论是否经过压力加载，其在体的修复软骨能力都受到明显抑制。综合以上结果，我们发现了一个全新的力学信号敏感分子ANTXR1，它在压力促BMSCs细胞膜片成软骨响应中起到重要作用。另外，我们从一个全新角度挖掘出它在干细胞力学信号转导中的作用，研究结果有望为开发力学可控性组织工程关节软骨修复策略提供更特异、更有效的作用靶点。