c-kit/Nkx2.5自体心脏干细胞修复受损传导系统研究

运用组织工程技术构建能与自体心肌良好偶联的生物传导系统是治疗由于发育缺陷或外科/介入手术所导致严重心脏传导阻滞的迫切要求。合适的种子细胞和三维支架材料是构建生物传导系统的重要前提，而c-Kit、Nkx2.5等心脏干细胞分子标志的发现为种子细胞的来源开辟了新的途径。本研究计划在构建Nkx2.5-EGFP转基因小鼠的基础上，分选并鉴定来源于新生小鼠自体心脏的c-kit/Nkx2.5干细胞这一可靠的前体细胞，在细胞因子endothelin-1和新生小鼠心肌细胞的协同促进下诱导其向传导细胞分化；同时进一步利用此组织工程传导细胞构建三维传导束模型并将其移植入体内受损的HPS传导部位，探讨其电生理属性和对传导功能的改善可能。

完全性房室传导阻滞是一些心脏手术后和许多后天性心脏病常见的严重危及生命的并发症，目前其唯一的治疗方法是安装人工心脏起搏器，但起搏器尚存在诸多无法克服的缺点。本研究旨在通过构建组织工程传导束重建心房与心室间心脏传导束的连续性，为治疗完全性房室传导阻滞提供一条新的途径。鉴于有研究表明，心脏传导细胞和心肌工作细胞均来源于胚胎早期原始心管中多能心脏干细胞，后者亦存在于成体心脏中。内皮素-1（ET-1）作为一种来源于心内膜和动脉血管内皮的旁分泌信号能够诱导心脏传导细胞的分化成熟。我们拟用自体心脏干细胞为种子细胞，通过ET-1诱导其朝心脏传导细胞分化，并结合组织工程材料来构建传导束。.本研究，我们首先完成了新生小鼠心脏干细胞体外培养和鉴定。结果：⑴c-kit为标志的心脏干细胞约占心脏细胞总数的0.65%，而流式和免疫磁珠分选得到有活力的c-kit 干细胞纯度为96.3%。⑵传代后绝大多数干细胞c-kit表达仍呈阳性，少数c-kit干细胞同时表达心肌特征性转录因子Nkx2.5或GATA-4，而cTnT、ANP等心肌结构基因不表达。⑶在5-aza的诱导下，c-kit 干细胞能够分化为表达心肌结构蛋白的心肌细胞，但并不具有成熟心肌细胞的自律性和收缩特征。其次，我们研究了内皮素-1调控 P19细胞向心脏传导细胞方向分化机制。结果：⑴ET-1能够上调P19细胞Nkx2.5、Tbx5、GATA-4、MEF2C等心肌早期特征性转录因子和 MHC-α、cTnT、ANP 等心肌结构基因以及传导系统特征表型 Cx40的表达。⑵ET-1诱导心脏传导细胞分化需要与特异性受体ETA和ETB结合。ET-1主要通过ETA通路上调 Nkx2.5 和Cx40表达水平从而诱导P19细胞向传导细胞分化。ETB通路可能参与了负反馈调节通路以阻止过多的早期心肌细胞向快传导细胞分化。⑶ET-1能够通过PI3K-AKT-mTOR信号通路调控Nkx2.5基因的表达水平进而影响传导细胞分化。.本研究表明，我们分选得到的c-kit 干细胞是一类来自心脏本身、具有心肌细胞分化潜能的干细胞，同时肯定了 ET-1 在体外诱导 P19 细胞向心脏传导细胞分化的能力。这为我们将来在体外建立稳定的新生或成体心脏干细胞系的基础上，进一步将其诱导分化并和组织工程材料一起构建三维传导束来修复受损的心脏传导系统提供了重要的理论基础和技术支持。