线性泛素化缺陷和K63泛素化缺陷导致自身炎症疾病的分子机制

OTULIN and A20 are the most important linear deubiqutinase and K63 deubiquitinase, both of which play critical roles in the inflammation and immunity. The applicant firstly identified mutant OTULIN and A20 causing monogenic inherited disorders，which opened a new area of investigating the regulation mechanisms of OTULIN and A20 in human. The applicant demonstrated that OTULIN defect and A20 defect resulted in the upregulation of NF-kB. However, OTULIN defect (Otulipenia) and A20 defect (HA20) patients have totally different clinical manifestations, indicating additional signaling pathways are involved. The primary data showed that IFN signaling may also play important roles in the pathophysiology. The purposed project plan to use IFN luciferase reporter assay, Nanostring, RNA seq, Realtime PCR, immunoprecipitation, western blot methods to study the regulation of IFN signaling in HA20 and Otulipenia, identify the new substrates of OTULIN and A20 in the IFN signaling pathway, compare the differences of OTULIN defect and A20 defect in affecting the IFN signaling pathway, and better understand the pathogenesis of Otulipenia and HA20.

OTULIN和A20是重要的去线性和去K63泛素化酶，在炎症和免疫中有重要调控作用。申请人首次发现了OTULIN突变和A20突变导致的单基因遗传病，开启了对OTULIN和A20在人体中作用的研究。申请人之前研究发现了OTULIN缺失和A20缺失对NF-kB通路的影响。然而，OTULIN缺陷（Otulipenia）和A20缺陷（HA20）病人的表型截然不同，暗示还有更多的信号通路被调控。申请人初步的结果提示IFN信号通路在Otulipenia和HA20的致病机制中也起到关键的作用。本课题将通过IFN报告基因检测，Nanostring，RNA测序，RealtimePCR，免疫共沉淀，western blot等实验研究HA20和Otulipenia的IFN的信号通路的变化。发现OTULIN和A20在IFN通路上新的底物，研究OTULIN和A20突变对IFN信号通路的调控差异，揭示病人的致病原理。

本课题研究发现OTULIN缺陷的患者细胞中IFN-I信号通路过度激活，并发现蛋白酶体亚基可以作为OTULIN去泛素化的底物，OTULIN缺陷会导致蛋白酶体复合体的组装缺陷和酶活降低。通过转录组学分析、细胞因子蛋白水平分析等，作者发现患者的外周血单个核细胞、单核细胞和血清中除了NF-κB信号通路上调，IFN-I信号通路的激活相比健康对照也存在显著的上调。通过免疫共沉淀-质谱实验发现OTULIN与蛋白酶体复合体的多个亚基存在免疫共沉淀，这提示线性泛素化可能参与了蛋白酶体组装或者酶活的调节。通过蛋白酶体酶活检测和非变性电泳等实验发现患者来源的成纤维细胞和外周血单个核细胞中的蛋白酶体复合体均出现了组装的缺陷和酶活的降低，进而引起细胞中K48多聚泛素化蛋白的累积。研究发现部分蛋白酶体亚基，包括免疫蛋白酶体亚基，可以作为LUBAC复合体和OTULIN的底物，发生线性泛素化修饰。而OTULIN缺陷导致的细胞中线性泛素链累积会影响蛋白酶体的组装和酶活。本研究首次报道OTULIN缺陷会导致病人细胞中IFN-I炎症信号通路过度激活，为患者治疗方案选择使用JAK抑制剂提供了理论指导。同时本研究鉴定出多个蛋白酶体亚基可以作为OTULIN去线性泛素化的底物，首次发现蛋白酶体的线性化修饰，而OTULIN缺陷导致患者细胞中蛋白酶体组装和酶活的缺陷。临床上， OTULIN缺陷与另一种自身炎症性疾病CANDLE综合征的临床表型非常相似。编码蛋白酶体亚基的基因如PSMB8、PSMB10等发生突变可导致CANDLE综合征，CANDLE综合征是属于I型干扰素病， IFN信号通路过度激活。与CANDLE患者类似，OTULIN缺陷患者细胞中蛋白酶体组装和酶活的缺陷，从而引起细胞内泛素化-蛋白酶体相关信号的紊乱，进而导致患者体内I型干扰素信号通路的过度激活和炎症表型。因此从机制上解释了OTULIN缺陷和蛋白酶体缺陷CANDLE综合征的两种疾病临床表型的高度一致性，为自身炎症性疾病的发病机制提供了新的线索。以通讯作者在Science Advances杂志发表了题为 “Deubiquitination of proteasome subunits by OTULIN regulates type I IFN production” 的研究论文。