水飞蓟宾对糖尿病性骨质疏松的保护作用及其机制研究

Diabetes osteoporosis (DO) is one of the major complications of diabetes. DO is a high incidence disease and is lack of effective treatments. Studies have shown that high glucose-induced oxidative stress is one of the main mechanisms for the onset of DO. Silibinin is a flavonoid lignin compounds with antioxidant, osteogenic, anti-diabetic, but there is no direct evidence against the DO effect. Our previous experiments have found that silibinin inhibited the HG-induced ROS increase, and can activate PI3K/Akt signaling pathway. We speculate that silibinin can improve DO. The study intends to culture hBMSCs in vitro, using ELISA, Real-time PCR, Western Blot combined with siRNA vector-mediated RNA interference to study the effect and molecular mechanisms of silibinin on DO; Further studies to assay the intervention effect of silibinin on DO using pathology, immunohistochemistry, bone density testing and other means by building DO animal model. The study is a great significance for elucidate the pathogenesis mechanism of DO, and provide a theoretical basis for clinical treatment DO.

糖尿病性骨质疏松症（DO）是糖尿病重要并发症之一，发病率高，危害严重，目前尚缺乏有效的治疗手段。研究表明，高糖引起的氧化应激是DO发病的主要机制之一。水飞蓟宾是一种天然的黄酮木质类化合物，具有抗氧化、促成骨、抗糖尿病等作用，但其对DO作用尚无直接证据。我们前期预实验发现水飞蓟宾能抑制高糖环境下hBMSCs ROS产生，并能激活PI3K/Akt信号通路。基于此，我们推测水飞蓟宾具有改善DO的作用。本课题拟通过体外培养hBMSCs，采用ELISA、Real-time PCR、Western Blot结合siRNA载体介导的RNA干扰技术等方法来研究水飞蓟宾对高糖环境下hBMSCs成骨分化的保护作用及机制；进一步通过构建DO动物模型，采用病理切片、免疫组化、骨密度检测等手段研究水飞蓟宾对DO的干预作用。该研究对阐明DO发病机制具有重要意义，并将为临床治疗DO提供理论依据。

糖尿病性骨质疏松症（DO）是糖尿病重要并发症之一，植物提取素水飞蓟宾具有促成骨、改善糖尿病周围神经病变、抗氧化、抗炎等作用，本课题在体外模型中，采用MTT法检测高糖环境对hBMSCs细胞活性的影响，并采用碱性磷酸酶（ALP）染色、 Von Kossa 染色及实时定量PCR检测高糖对hBMSCs成骨分化的影响及水飞蓟宾对其干预作用；并从PI3K/Akt及Wnt/β-catenin信号通路探讨其作用于hBMSCs的分子机制。采用高脂高糖饲料喂养并联合小剂量STZ腹腔注射法诱导2型糖尿病大鼠模型，采用股骨X片、骨密度指标、microCT、骨组织形态学变化及HE染色检测水飞蓟宾对DO的干预作用；研究发现10,20及30mM的高糖能轻微增加hBMSCs的增殖，40mM的高糖明显抑制hBMSCs 增殖及活性；本课题采取30mM浓度糖浓度进行进一步实验。30mM高糖能抑制hBMSCs成骨分化，抑制COL-I, ALP, OCN, BMP-2, RUNX2等相关基因的表达，水飞蓟宾（10 及100 μM)）能减轻上述抑制作用，研究还发现高糖（30mM葡萄糖）显著抑制hBMSCs PI3K及Akt磷酸化，水飞蓟宾（10及100μmol/L）预处理后能部分逆转上述现象，高糖环境能下调β-catenin表达，水飞蓟宾能部分恢复由高糖所致的β-catenin下调。动物实验研究发现糖尿病组大鼠股骨t-BMD、骨小梁BV/TV、Tb.N 和 Tb.Th明显下降，飞蓟宾(100 mg/ kg/day)能够扭转这一负面趋势；研究还发现水飞蓟宾能减少尿8-羟基脱氧鸟苷的排泄，减轻体内氧化应激，并能增加骨钙素含量。课题组还采用细胞实验研究了水飞蓟宾对IL-1β刺激下OA 病人软骨细胞的影响，建立小鼠骨关节炎模型来评估其对OA 发生及炎症反应的影响。研究发现水飞蓟宾能够明显抑制IL-1β诱导的炎症因子（IL-6，TNF-a，NO、PGE2）及基质金属蛋白酶（MMP-1, MMP-3, MMP-13）的表达, 并发现上述作用是通过抑制NF-κB的激活和PI3K/Akt的磷酸化实现的。动物实验中水飞蓟宾能够明显抑制小鼠关节软骨破坏，减轻滑膜炎，明显减少OA大鼠软骨相关蛋白及基质金属蛋白酶的表达。综上所述，水飞蓟宾对糖尿病骨质疏松及骨关节炎有一定的保护作用，为其在临床应用提供理论依据。