河蟹螺原体和非凡螺原体对脊椎动物嗜神经感染机制的研究

根据河蟹螺原体和非凡螺原体能侵染脊椎动物（鸡胚和新生小鼠）并表现出嗜神经感染特征，利用河蟹螺原体和非凡螺原体基因组信息以及鸡和小鼠基因组信息，从体外培养、组织水平、细胞和分子水平上开展两种螺原体对脊椎动物嗜神经感染机制的研究和比较。建立感染动物模型并用免疫组化和电镜技术观察螺原体对寄主的侵染特点；利用与寄主磷脂代谢及免疫相关基因定制芯片，检测寄主感染螺原体后相应基因的差异表达，并用实时定量PCR方法验证；运用液质联用技术探讨螺原体感染后对寄主蛋白表达的影响；用Far-western blotting和GST Pull down技术进行螺原体与寄主神经类细胞互作蛋白的筛选与鉴定；用电镜、差异荧光双向电泳和质谱技术检测不同磷脂含量培养下螺原体的生长、形态和蛋白表达的变化，筛选与磷脂代谢相关的蛋白。综上研究，揭示河蟹螺原体和非凡螺原体对脊椎动物嗜神经感染机制，探讨水生螺原体与陆生螺原体的关联。

证实河蟹螺原体能够感染乳鼠产生白内障，并建立了相关动物模型，同时还建立了小鼠胚胎成纤维细胞（3T6）和小鼠晶状体上皮细胞（MLEC）的螺原体感染模型，并在此基础上开展了表达谱芯片筛选及互作蛋白的筛选。通过表达谱芯片筛出437个上调基因和183个下调基因，同时还用microRNA芯片筛选到22个差异表达的micrRNA，对所筛选出的靶基因进行预测，然后将靶基因与表达谱芯片的结果进行联合分析，发现这些基因在新陈代谢通路、MAPK通路和粘附通路有大量存在，此两条通路与螺原体感染关系密切。针对联合分析的靶基因，采用Realtime-PCR和Western Blot的方法进行验证，最终得出：ERK通路在螺原体感染过程中起到重要的作用。此外，在开展螺原体与宿主细胞互作蛋白筛选中，利用从罗氏沼虾血淋巴细胞感染螺原体后筛选到的相关配体蛋白信息，在3T6细胞上进行验证，证实配体蛋白烯醇化酶在螺原体侵染小鼠3T6过程中也起到重要作用。螺原体体外不同磷脂含量培养条件下的比较实验显示，在胆固醇组和脑磷脂组中螺原体都聚集成团，而对照没有，表明螺原体在有脂类物质和无脂类物质环境下有不同反应。为了进一步探讨螺原体对磷脂类物质的反应方式，本项目应用毛细管实验和显微镜观察装片实验开展了河蟹螺原体趋化性研究，发现河蟹螺原体对卵磷脂（PC），甲硫氨酸（Met），葡萄糖（Glc）等物质都喜好，其中对卵磷脂（PC）趋化作用最强，这一实验结果很好地解释了为什么河蟹螺原体对富含卵磷脂的组织（如虾蟹中枢神经、结缔组织等，乳鼠的脑部及视神经等）具有特异性的侵染，从而造成虾蟹附肢颤抖及小鼠白内障等病症。