人博卡病毒(HBoV1)非结构蛋白NP1在病毒复制过程中的作用及其机制

Human bocavirus ( HBoV1) is one of the two parvoviruses that cause human diseases in the Family Parvoviridae. In the past few years, the studies of human bocavirus are mainly focused on establishment of detection method and epidemiological investigations. The applicant of this proposal collaborated with Dr. Qiu's laboratory from the Kansas university in the United States has recently cloned the full-length genome of the virus, which provides an important tool for further studying the mechanism of viral replication. The functions of the two non structural proteins including NS1 and NP1 of HBoV1 have not been determined yet. The objectives of this proposal are: (1) To analyze the effect of this non-structural protein on viral replication by constructing the HBoV1 full length genome which does not express non-structural protein NP1 through the method of point mutations; (2) To study the export machanisms of the HBoV1 NP1 and its effect on virus release as well as virus replication; (3) To confirm the possible interaction of NP1 with Nup214 or NOLC1 and undertand the influences of these interacting proteins on the virus replication; (4) To investigate whether the non-structural protein NP1 induces cellular DNA damage and cell death as well as involved signaling pathways. The project will focus on the study of the non-structural protein NP1 of HBoV1 to explore the interaction between virus and cells as well as its molecular mechanism of non-structural protein NP1 of HBoV1 during the viral replication, it would provide new insight for revealing virus pathogenesis.

人博卡病毒HBoV1是近年被发现的可引起人类疾病的细小病毒，由于缺乏感染性克隆，以往对该病毒的研究主要集中于检测方法的建立和感染的流行病学调查。最近申请人通过国际合作首次克隆了该病毒的全基因组，筛选到了允许细胞系，建立了反向遗传操作系统，为该病毒复制机理的研究奠定了重要的基础。NP1是HBoV1仅有的两个非结构蛋白之一，其功能尚不清楚。本项目拟：（1）采用点突变技术构建缺失HBoV1的NP1蛋白的病毒全基因组克隆，分析NP1缺失对病毒复制多个阶段的影响；（2）解析NP1的出核运输机制及其对病毒转运和释放的作用；（3）确证已经初步获得的核孔蛋白Nup214 和核螺旋体磷酸化蛋白NOLC1与NP1相互作用，分析其对病毒复制的影响；（4）探究NP1是否可引起受纳细胞DNA损伤和细胞死亡及其对病毒产量的影响。旨在揭示NP1蛋白在HBoV1复制过程中的作用及其分子机制，为病毒病理研究提供重要的参考。

人博卡病毒可以体外感染人极化气管上皮细胞，引起细胞的病变，其生物学特性、复制过程以及致病的分子机制有待深入的研究。基于此，本项目开展了以下工作：1、构建了缺失NP1基因的人博卡病毒全基因组克隆pIHBoV1ΔNP1，并分析了缺失NP1基因对人博卡病毒核酸复制的影响。结果显示，缺失NP1后的pIHBoV1ΔNP1核酸无法复制。2、分析了NP1的细胞内定位情况，结果显示：缺失130-138aa、130-133aa、134-138aa后，NP1主要在细胞质分布，在细胞核内相对较少，表明134-138aa序列对NP1的细胞定位有重要作用。3、免疫共沉淀检测了与NP1互作的宿主核输入蛋白，包括NUP214、NUP153、NUP98、NUP62、NUP50。建立shNUP214 293T的稳定细胞系。在shNUP214 293T细胞系上，NP1的入核时间在24h左右，敲低核输入蛋白NUP214在一定程度上延长了NP1的入核时间，影响NP1在细胞内定位。4、NP1可引起HEK293T细胞的DNA损伤。然而，在肺来源的传代细胞系A549细胞上，NP1不会诱导A549细胞凋亡，但会诱导细胞自噬，自噬的发生主要与STAT3信号通路的活化有关。5、利用生物学数据库GO和KEGG分析与NP1相互作用的候选蛋白的生物学功能，利用CO-IP分析与NP1存在直接或间接相互作用的蛋白；利用shRNA分别敲低宿主细胞相关蛋白后，探究NP1利用宿主细胞的关键蛋白影响病毒mRNA加工及衣壳蛋白翻译的机制。结果显示，NP1可与NSRP1、hnRNPR、hnRNPF、DHX15、CPSF6直接互作，与FIP1L间接互作；敲低CPSF6后，HBoV1结构蛋白VP的表达量以及HBoV1 VP mRNA的水平显著下调。6、构建人博卡病毒结构蛋白VP2 N端210个氨基酸（VP2N）的原核表达质粒pET28a-VP2N。并制备VP2N的多克隆抗体。发明了人博卡病毒抗体间接ELISA 诊断试剂盒。7、建立了可稳定表达NS1-100、NS1-70蛋白的HEK 293T细胞系。并在稳定表达NS1细胞系中转染HBoV1启动子-荧光素酶基因的质粒，分析NS1的反式转录激活活性。结果表明稳定表达NS1蛋白对HBoV1启动子有较强的激活活性。本研究为揭示HBoV1致病机制及进一步诊断和防控人博卡病毒提供理论依据。