日本血吸虫丝/苏氨酸蛋白磷酸酶编码基因（Sj-stp）的鉴定及其与生殖相关功能的研究

Schistosoma is an important parasite causing seriously health problems to human. The maturation of females' gonad and subsequent eggs laying which results in pathogenic damages to the definitive host are proved to depend on the pairing of mature males to the females. However, there is still a paucity of information on the molecular mechanisms involved in the regulations of reproductive development of male parasite. It was reported that signalling pathways palyed important roles in the reproductive biology of schistosoma. Although serine/threonine phosphatase (STP), one of the signalling molecules, was determined to be related to the spermiogenesis and motility of sperms in animals and parasite, nothing is known about its reproductive functions in schitosoma. Therefore, the present project intends to perform the structural analysis and classification of serine/threonine protein phosphatase-encoding genes from Schistosoma japonicum (Sj-stp) and subsequently investigate their functions involved in the reproductive process (such as spermatogenesis, oogenesis, pairing between males and females and formation of normal eggs) of this parasite. Besides theoretically explaining the reproduction related roles of Sj-stp in S. japonicum, the findings from this project will provide a basis for further understanding the molecular mechanism underlying the interactions between males and females, as well as a new clue to develop efficient drug targets and vaccine candidates, laying profound foundations for seeking novel strategies for schistosomiasis.

血吸虫是严重危害人类健康的重要寄生虫。其成熟雄虫对雌虫的合抱行为是雌虫生殖腺发育成熟并大量产卵、最终对终宿主致病的基础。然而，有关调控血吸虫雄虫生殖发育的分子机制所知甚少。据报道信号传导通路对血吸虫生殖发育起到重要的调控作用。而信号传导分子之一的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(STP)与动物和寄生虫精子的形成及运动性有关，但有关该酶在血吸虫生殖发育中的作用一无所知。本项目拟以日本血吸虫为研究对象，用现代分子生物学技术分析血吸虫体内该酶编码基因的结构，并确定其分类及在日本血吸虫生殖过程(精卵细胞的发生、雌雄合抱及正常虫卵形成)中的功能。本课题的完成，不仅能从理论上解释Sj-stp在血吸虫生殖细胞发育和雌雄合抱过程中的作用，为进一步深入研究血吸虫雌雄虫相互作用的分子机制提供实验依据，而且也为开发血吸虫新的药物靶点以及疫苗候选分子奠定理论基础，对寻找防制人、畜血吸虫病的新方法具有十分重要的意义。

据报道，丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(STP)与动物和寄生虫生殖发育有关，尤其与精子的形成及运动性的调控有关，但有关该酶在血吸虫生殖发育中的作用却一无所知。本研究以日本血吸虫为研究对象，用现代分子生物学技术分析血吸虫体内该酶编码基因的结构，并确定其分类及在日本血吸虫生长发育和生殖过程中的功能。本研究通过RACE-PCR的方法克隆已获得9个Sj- STP编码基因的ORF。其中Sj-pp1不仅具有蛋白磷酸酶(PPs)的特征序列，并具有PPs特异性抑制剂的结合位点。通过生物信息学比对方法，对三个已获得基因结构的Sj-pp1基因进行系统进化树分析，结果表明Sj-pp1-1、Sj-pp1-2和Sj-pp1-3三个基因编码蛋白分属于PP1beta、PP1gamma和PP1aphla亚家族。Real-time PCR结果显示：三个Sj-pp1基因在各个不同发育阶段的虫体内均有表达，且在虫卵内转录水平最高，在雄虫中略高于雌虫，以Sj-pp1-2的差异最为显著(p<0.01)。单性体外培养雌雄虫体内Sj-pp1-1表达水平高于合抱培养虫体内Sj-pp1-1的表达水平，但差异不显著；单性培养3d又重合抱培养6d的雌雄虫Sj-pp1-1表达水平显著高于合抱培养9d的雌雄虫体内的水平(p<0.05)。原位杂交结果显示Sj-pp1-1基因主要定位于日本血吸虫雄虫的睾丸、实质部分、皮下组织及头部的腺体周围区域，还定位于雌虫的卵模周围区域，另外在卵巢部分也有微弱表达。通过dsRNA浸泡法对体外培养雌雄虫Sj-pp1基因进行干扰后(干扰效率达66%-95%)观察发现：1.干扰组雌雄虫体长显著小于空白对照及阴性对照组虫体体长(p<0.001)；2.干扰组雌虫卵巢面积显著减小，成熟卵母细胞数量减少，卵黄腺细胞成熟度下降，卵巢和卵黄腺内细胞有丝分裂活性降低，产卵量下降(P<0.001)；3.干扰组雄虫睾丸明显萎缩，睾丸内精母细胞数量减少，贮精囊内成熟精子数量减少，睾丸和实质部位细胞的有丝分裂活性降低；4.干扰组合抱雌雄虫逐渐分离，随着干扰时间的延长，雌雄虫分离数目显著增加(P<0.001)，且在干扰12天后，Sj-pp1干扰组的雌雄虫全部分离(p<0.001)。本研究结果表明Sj-pp1基因在日本血吸虫生长发育、生殖细胞发育以及雌雄虫合抱过程中发挥着重要作用。