非天然氨基酸调控的黄病毒反向遗传学技术平台的建立与应用

Genetic code expansion is a new biochemical technique which enables a blank codon to encode for an unnatural amino acid. The strategy has been widely used for site-specific incorporation of unnatural amino acids with unique properties into proteins, and attracted extensive attention. Recently, a research of the generation of replication-incompetent influenza A viruses controlled by unnatural amino acids as live vaccines was published in Science. The genus Flavivirus is a kind of single-stranded RNA viruses, including various pathogenic species which can cause human illness. Previously, we have successfully established several reverse genetic systems of flavivirus. In this study, a panel of unnatural amino acid dependent recombinant mutants will be generated by the combination of genetic code expansion strategy and flavivirus reverse genetic techniques. Moreover, amber stop codons will be introduced into the reading frame of a functional protein NS1＇ to recover a series of recombinant viruses encoding truncated forms of proteins, and the expressed forms can be regulated by the supplement of unnatural amino acids. The phenotypes of the recombinant viruses controlled by unnatural amino acids will be subsequently evaluated by biochemical, virological as well as in vivo animal model approaches, including the viral protein expressions, replication efficiency, immunogenicity and immunoprotection. This project will develop a novel flavivirus reverse genetic system under the control of unnatural amino acid. This work is of great importance to the precisely aimed regulation and control of RNA virus biological characteristics.

基于非天然氨基酸的遗传密码子拓展是化学生物学领域的新兴技术，可将非天然氨基酸精确地引入到蛋白质的特定位置。最近，这一技术在病毒蛋白定向修饰领域受到广泛关注，《科学》杂志对利用该技术构建复制缺陷型流感疫苗候选株的亮点工作进行了报道。黄病毒是一类具有代表性的单链RNA病毒，包含多种重要人类病原体。本研究将黄病毒反向遗传学技术与遗传密码子拓展系统相结合，获得非天然氨基酸调控的条件感染性重组病毒。在此基础上，在黄病毒重要功能蛋白NS1＇的不同位点引入非天然氨基酸，表达不同形式的重组蛋白。随后通过一系列病毒学、生物化学和动物实验，明确非天然氨基酸调控下病毒蛋白表达水平、复制能力及致病性等生物学特性的差异，进而评价其免疫原性和免疫保护作用。通过上述研究将建立非天然氨基酸调控的黄病毒反向遗传学技术平台，直接在蛋白质水平实现对病毒生物学表型的精确控制，为RNA病毒的靶向调控和定向改造提供了新的技术途径。

基于非天然氨基酸的遗传密码子拓展是化学生物学领域的新兴技术，可将非天然氨基酸精确地引入到蛋白质的特定位置。这一技术在病毒蛋白定向修饰领域受到广泛关注。RNA病毒包含多种重要的人类病原体，本研究主要将病毒的反向遗传学技术与遗传密码子拓展技术相结合，获得非天然氨基酸调控的条件感染性重组病毒，建立非天然氨基酸调控的RNA病毒反向遗传学技术平台；在此基础上，在病毒重要功能蛋白的编码区引入非天然氨基酸，通过一系列病毒学和生物化学等实验，明确非天然氨基酸调控下病毒蛋白表达水平、复制能力等重要生物学表型的差异，最终在蛋白质水平实现对病毒生物学表型的精确控制，为RNA病毒的靶向调控和定向改造提供新的技术途径。.在该项目资助下，本研究首先完成了基于氨酰tRNA合成酶-tRNA正交系统的遗传密码子拓展系统的鉴定和验证，获得能够稳定表达该正交系统的细胞系；评价了非天然氨基酸在不同细胞系中的利用效率；在此基础上，将琥珀终止密码子引入寨卡病毒NS5蛋白编码序列的不同位置，拯救获得了3株携带终止密码子的重组寨卡病毒，评价了非天然氨基酸调控下重组病毒的在不同细胞系中的蛋白表达水平、复制能力和感染性，系统评价了重组病毒的遗传稳定性，建立了基于遗传密码子拓展技术的黄病毒反向遗传学系统；同时，将琥珀终止密码子靶向引入流感病毒NS1蛋白编码区，拯救获得携带终止密码子的重组流感病毒，通过非天然氨基酸调控病毒NS1蛋白的表达，实现其对重组病毒增殖能力、病毒感染引起的细胞病变效应以及病毒感染引起的细胞凋亡效应等一系列重要生物学表型的靶向调控。.综上，本研究将遗传密码子拓展技术应用于不同类型的RNA病毒，建立了基于遗传密码子拓展技术的黄病毒反向遗传学系统，并通过非天然氨基酸调控病毒重要功能蛋白的表达，实现了其对活病毒重要生物学表型及其感染生物学效应的靶向调控。