东方田鼠抗日本血吸虫相关基因ILKAP功能的初步研究

前期研究中已筛选得到了东方田鼠抗日血吸虫抗性相关基因E77.43的cDNA片段，该片段转染人胚肾（HEK293）细胞系，表达产物具有明显的体外杀伤日本血吸虫童虫作用。随后，我们采用RACE等方法获得E77.43全长cDNA序列，序列相似性搜索和多序列比对结果表明E77.43编码的产物为ILKAP。本研究拟从ILKAP编码蛋白杀伤日本血吸虫童虫的体外活性测定、体内基因治疗实验、在东方田鼠和小鼠感染日本血吸虫前后不同组织分布特征、建立转基因小鼠模型等方面系统的探讨该基因的构特征与抗日本血吸虫感染的生物学功能。试图从一个全新的视野为阐明东方田鼠抗日本血吸虫的抗性分子机理提供理论依据，为血吸虫病的防治提供新的线索。

流行病调查发现东方田鼠是唯一一种感染日本血吸虫后不致病的啮齿类哺乳动物，而且这种特性能够稳定遗传，这提示东方田鼠体内可能存在与其天然抗日本血吸虫相关的基因。前期研究中，我们从东方田鼠体内获得了一个对日本血吸虫童虫有体外杀伤活性的抗日本血吸虫相关基因ILKAP。本研究中，我们从分析东方田鼠ILKAP的结构与功能等方面系统的探讨了东方田鼠ILKAP基因的结构特征与其体内外抗日本血吸虫的生物学功能。生物信息学分析表明，东方田鼠ILKAP蛋白质序列在进化树的位置上与小鼠及褐家鼠距离最小，亲缘关系最近。东方田鼠与小鼠ILKAP蛋白质在羧基端存在一定的空间结构差异;ILKAP基因在东方田鼠和小鼠不同组织中表达情况有较大差异，ILKAP基因在东方田鼠在脾脏、肺脏及骨髓中表达较高，在肌肉等组织低表达；我们扩增了MF-ILKAP的部分编码序列，并将其克隆到原核表达载体pQE30，进行了原核表达，并用纯化后的蛋白作为抗原免疫家兔制备了多克隆抗体；将东方田鼠ILKAP基因重组到真核表达载体 pcDNA1.1，制备了东方田鼠ILKAP条件培养基，该条件培养基体外杀伤日本血吸虫童虫效果较明显；为进一步解析东方田鼠ILKAP的体内抗日本血吸虫活性，我们建立了GV208-ILKAP重组慢病毒载体系统，通过小鼠尾静脉注射，将重组慢病毒导入小鼠体内，检测了重组病毒治疗后感染日本血吸虫小鼠的减虫率、肝脏减卵率等情况。GV208-ILKAP重组慢病毒治疗组与DMEM处理组、空载体GV208病毒对照组相比，小鼠肝脏减卵率有较明显差异；采用免疫共沉淀结合质谱的方等法明确了日本血吸虫表膜蛋白TA是与MF-ILKAP相互作用的蛋白。我们的研究结果为进一步研究ILKAP抗日本血吸虫机制以及深入阐明东方田鼠抗日本血吸虫感染的分子机理奠定了良好的基础。