犬弓首蛔虫丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因的鉴定和功能研究

弓首蛔虫病是一种重要的人兽共患疾病，而丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因在寄生线虫的生长、发育、存活及繁殖过程中起着重要的作用。本项目首先基于已构建的犬弓首蛔虫成虫cDNA文库，通过EST测序及序列分析，RT-PCR验证，鉴定犬弓首蛔虫的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶（Tc-stp）基因。然后采用RACE技术克隆Tc-stp基因，构建该基因的原核表达载体，用纯化的蛋白制备多克隆抗体，以免疫组化方法，对该蛋白在犬弓首蛔虫进行组织定位研究，推测丝/苏氨酸蛋白磷酸酶在犬弓首蛔虫的功能；并对重组蛋白进行动物免疫保护研究，观察重组蛋白的免疫保护力。同时对该基因进行真核表达和RNAi，检测表达蛋白的活性和虫体被靶基因干扰的效果。本项目的顺利实施为进一步研究犬弓首蛔虫丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因的生物学功能奠定基础，同时为后续研究犬弓首蛔虫的致病机理，寻找抗病相关靶抗原和开拓新的治疗药物途径提供广阔的分子平台。

丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(protein serine/threonine phosphatases, PP)是蛋白磷酸酶家族中重要的细胞内调节分子，其中丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1（PP1）是该家族的重要成员，参与调节细胞分裂、蛋白质合成、代谢、细胞骨架重组和信号传导等多种细胞生物学过程，PP1发挥生物学功能需要PP1催化亚基和PP1调节亚基的结合。本课题利用犬弓首蛔虫的ESTs数据，鉴定得到了8个犬弓首蛔虫的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶（Tc-stp）基因。然后采用5’RACE技术扩增了犬弓首蛔虫PP1 的催化亚基（Tc-PP1c）和PP1的调节亚基（Tc-PP1r）基因序列，获得了Tc-PP1c基因全长为1192bp（命名为Tc-stp-1），Tc-PP1r基因序列为725bp（命名为Tc-pp1r-7）；利用实时荧光定量PCR技术对Tc-stp-1和Tc-pp1r-7在雌、雄成虫和雄虫各组织中的转录水平进行了研究，结果表明Tc-stp-1和Tc-pp1r-7均在T. canis雄虫精巢、输精管中高量表达，而在雌虫中表达量极低。构建了该蛋白的原核表达载体Tc-stp-1/pET 28a（+），利用纯化的蛋白制备了多克隆抗体，以免疫组化方法，对该蛋白在犬弓首蛔虫的组织分布进行了定位，发现Tc-PP1cα特异性地分布于雄虫生殖组织，主要集中于精巢、贮精囊、输精管，特别是精细胞中。同时构建了该蛋白的真核Tc-stp-1/pSL 1180表达载体，利用间接荧光技术检测了在细胞中的分布，发现Tc-PP1cα主要分布于细胞质。采用双链RNA干扰（dsRNAi）技术降低了Tc-stp-1的表达水平，结果显示干扰后Tc-stp-1在生殖组织中的转录出现时间和空间上的差异。本研究结果有助于我们了解PP1在寄生线虫发育和繁殖过程中的作用，为发现新的弓首蛔虫病防控治疗药物及疫苗靶点提供重要线索。已发表的研究论文12篇，其中SCI论文4篇，并提交SCI论文1 篇。