靶向TF的嵌合抗原受体修饰的T细胞治疗肺癌研究

The chimeric antigen receptor (CAR) is an artificial T cell receptor that simulates the physiological functions of the native T cell receptor (TCR). CAR-modified T cells for cancer therapy has been extensively studied in recent years. Some clinical trials have shown significant effect. However, there are still some problems to be solved. Two of them are most critical. One is determining effective tumor target, another is decreasing the immunogenicity of CAR to prolong the survival of CAR-modified T cells in vivo. Tissue factor (TF) is overexpressed in malignant tumor cells and angiogenic tumor vascular endothelial cells, and had been proved an effective target for cancer therapy. The results of our previous research have demonstrated that tissue factor is overexpressed in lung cancer cells, is an effective target for lung cancer therapy.Factor VII is the natural ligand of TF. We have proved that the light chain of factor VII (lFVII) is an ideal targeting molecule of TF. In this project, we will constructed a novel CAR which contains lFVII as the targeting domain and targets to TF, and study the therapeutic effect and mechanisms of the CAR-modified T cells for lung cancer. This study will provide theoretical and experimental basis for the CAR-modified T cells' clinical application for lung cancer.

嵌合抗原受体（CAR）是模拟T细胞受体功能的人工受体，近年来利用CAR修饰的T细胞治疗肿瘤的研究备受关注。一些临床试验已取得较好疗效，但仍有很多问题亟待解决，其中两个最为关键，一是确定有效的治疗靶点，二是降低CAR的免疫原性。 组织因子（TF）在恶性肿瘤细胞及新生肿瘤血管内皮细胞高表达，已被证实为多个肿瘤的有效治疗靶点。申请者的前期研究证明TF在肺癌细胞中高表达，是肺癌治疗的有效靶点；凝血因子VII的轻链（lFVII）能有效识别TF，且分子量小，无免疫原性，是TF的理想识别结构域。本项目拟在前期研究基础上，构建以TF为靶点，lFVII为靶点识别结构域的CAR，用其修饰T细胞，通过体内外实验研究该CAR修饰的T细胞对肺癌的治疗效果，并阐明其相关机制，为CAR修饰的T细胞应用于临床肺癌治疗提供理论和实验依据。

背景和目的 利用携带嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）mlFVII-CD8-CD28-4-1BB-CD3ζ编码基因的慢病毒载体感染人原代T淋巴细胞，通过体外实验研究该CAR修饰的T细胞对组织因子（tissue factor，TF）阳性的肿瘤细胞的免疫效应，体内实验研究其对TF阳性肿瘤模型的治疗效果。.方法及结果 1. 通过组织芯片及免疫组化技术检测发现TF在非小细胞肺癌(鳞状细胞癌、腺癌)及恶性黑色素瘤中的表达显著高于相应正常组织，差异具有统计学意义，TF在小细胞肺癌的表达较正常肺组织降低，差异具有统计学意义；通过流式细胞技术检测发现TF在NCI-H292细胞和B16F10细胞中高表达，在MCF-7细胞几乎不表达。 2. 通过分子克隆技术构建以TF为靶点，mFVII为靶点识别结构域的CAR，通过包装慢病毒并感染人原代T细胞制备CAR-T细胞，Western blot可检测到大小为55 KD的目的条带，流式细胞术检测CAR阳性率为57.0 %；荧光显微镜可观察到CAR在T细胞膜上的表达。3. ELISA实验检测发现CAR-T细胞能够特异性识别TF阳性的肿瘤细胞，并释放细胞因子，包括IFN-γ及perforin；4. LDH释放分析发现CAR-T细胞对TF阳性的肿瘤细胞具有特异性杀伤作用。5. 通过人肺癌NOG小鼠皮下移植瘤模型及肺转移模型的治疗实验证实，CAR-T细胞对人肺癌NOG小鼠皮下移植瘤生长及肺转移具有显著的抑制作用。 6. 通过免疫组化对浸入肿瘤的人T细胞的检测发现，T细胞能够浸润入肿瘤组织，且CAR-T组多于CON-T组(P<0.05)。.结论及意义 TF是一个潜在的实体瘤治疗靶点，本项目成功构建了以TF为靶点的CAR，并制备了相应的CAR-T细胞。该CAR-T细胞在体外对TF阳性的肿瘤细胞具有特异的杀伤作用，在体内对TF阳性的肿瘤的生长及肺转移具有显著的抑制作用。该研究结果为以TF为靶点的CAR-T细胞用于临床肿瘤治疗提供了理论和实验依据。