dMast解聚Cos2/PKA复合体调节Hedgehog通路活性机制研究

Hedgehog (Hh) signaling pathway plays an important role during embryonic development and pattern formation. Misregulation of Hh pathway results in various developmental disorders and increasing cancer incidence. In Drosophila，In the absence of Hh，Cos2 recruits kinase PKA，GSK3 and CK1 to phosphorylate Ci and mediate it partial degradation. In the presence of Hh, Hh dissociates the Cos2/PKA complex and blocks Ci degradation. How Hh dissociates the Cos2/PKA complex is a long-standing question. We find the kinase dMast is a novel regulator of Hh pathway. Hh enhances Cos2 recruitment of dMast which leads to dissociation of Cos2/PKA complex. The underlying mechanism is elusive. We use Drosophila as a model to address this question. Our study will unveil a new facet of Hh signaling regulation, and reveal a potential drug target for modulating Hh signaling activity.

Hedgehog（Hh）信号通路在胚胎生长发育和形态发生过程中发挥重要作用，通路活性异常可导致发育缺陷及肿瘤的发生。在果蝇中，没有Hh时，Cos2 招募PKA等激酶形成复合体，使转录因子Ci磷酸化进而水解，抑制Hh通路活性；当Hh存在时，Hh信号促进Cos2/PKA 复合体解聚，抑制Ci磷酸化及降解，激活Hh通路。Hh信号是如何促进Cos2/PKA 复合体解聚的是领域内长期未解决的问题。我们遗传筛选发现激酶dMast为Hh通路新的调节因子，Hh促进Cos2招募dMast，dMast促进Cos2/PKA 复合体解聚，具体机制不清。本项目就是利用果蝇作为模式生物研究dMast调节Cos2/PKA 复合体解聚的分子机制。该研究对于深刻理解Hh信号通路调节机制及开发治疗Hh通路相关癌症的新策略具有重大指导意义。

Hedgehog（Hh）信号通路在胚胎生长发育和形态发生过程中发挥重要作用，通路活性异常可导致发育缺陷及肿瘤的发生。在果蝇中，没有Hh时，Cos2 招募PKA等激酶形成复合体，使转录因子Ci磷酸化进而水解，抑制Hh通路活性；当Hh存在时，Hh信号促进Cos2/PKA 复合体解聚，抑制Ci磷酸化及降解，激活Hh通路。Hh信号是如何促进Cos2/PKA 复合体解聚的是领域内长期未解决的问题。我们遗传筛选发现激酶dMast为Hh通路新的调节因子，Hh促进Cos2招募dMast，dMast促进Cos2/PKA 复合体解聚，具体机制不清。本项目就是利用果蝇作为模式生物研究dMast调节Cos2/PKA 复合体解聚的分子机制，取得成果如下：（1）过表达dMast RNAi修饰UAS-Smo-PKA （Smo dominant negative突变体）果蝇翅膀表型。（2）用Ap Gal4在果蝇翅膀原基中过表达UAS-dMast RNAi 导致下调Hh通路转录因子Ci及靶基因 ptc-LacZ水平。（3）用ApGal4在果蝇翅膀原基中过表达UAS-dMast RNAi下调Ci水平，但Cipromoter-LacZ水平未受影响，表明Ci下调为蛋白水平, Ci转录水平未发生改变。（4）过表达UAS-dMast上调Hh通路转录因子Ci及靶基因 ptc-LacZ水平，而过表达dMast激酶活性破坏突变体UAS-dMastKD 不能上调Ci及ptc-LacZ水平，表明dMast 调节Hh通路依赖其激酶活性。（5）dMast与Cos2,Fu共定位。（6）IP实验显示 Hh调节dMast与Cos2结合，dMast促进Cos2/PKA复合体解聚。 (7) dMast影响Ci部分降解为Ci75。(8) 通过质谱分析发现dMast影响Cos2 292位丝氨酸（S）磷酸化，将丝氨酸（S）突变为天冬氨酸（D）模拟磷酸化，发现Cos2 S292D 突变体激活Hh通路。 (9) Mast进化过程中功能是保守的。该研究具有重要理论意义,研究可加深我们对Hh 通路调节的认识; 同时将有助于开发治疗Hh通路相关癌症的新策略，这对临床工作中针对性治疗具有重大指导意义。