可诱导自杀基因iCaspase9调控嵌合抗原受体修饰T细胞的脑胶质瘤靶向免疫治疗实验研究

Chimeric Antigen Receptor-Engineered T Cells bring new hope for tumor immunotherapy, which endow T cells target cytotoxicity, overcome local suppressive microenvironment of tumor, break immune tolerance of host. However, controlling of such supernatural T cells is a key issue in clinical gene and cellular therapy. We design an inducible suicide gene Caspase 9, combined with EGFRvIII CAR, establish controllable model of Chimeric Antigen Receptor-Engineered T Cells. Experiments in vitro will explore inducible apoptosis of CAR T cells, ideal T cell subgroups of therapeutic potential, best activation signal of T cells. Conditional CAR T ablation model, graft-versus-host disease model, in situ tumor engraft model will be used to discuss the control, safety and effect of CAR-based immunotherapy. EGFRvIII (Epidermal Growth Factor variant III) is a tumor specific antigen highly expressed in glioma and other malignant tumors, a promising molecular marker of tumor target therapy. Our study will provide experimental data for this new strategy of immunotherapy, controlling tool for clinical gene therapy, and new therapy for glioma.

嵌合抗原受体（CAR）修饰T细胞为肿瘤免疫治疗带来新的希望，它赋予T细胞靶向杀伤活性，克服肿瘤局部免疫抑制微环境，改善宿主免疫耐受状态。然而，这种"超自然"T细胞的调控是临床基因和细胞治疗需要解决的关键问题。本课题设计可诱导的自杀基因iCaspase9，与肿瘤特异性抗原EGFRvIII的CAR相结合，建立CAR修饰T细胞的调控模型；体外试验探讨iCaspase9诱导CAR T细胞凋亡、理想治疗潜质的T细胞亚群、最佳的T细胞活化信号；动物实验通过CAR T细胞条件性消融模型、移植物抗宿主病模型、肿瘤原位移植模型探索CAR修饰T细胞肿瘤免疫治疗的调控性、安全性、有效性，可能的分子机制和应对策略。EGFRvIII是脑胶质瘤等多种恶性肿瘤表达率很高的肿瘤特异性抗原，肿瘤靶向治疗理想的分子靶点，本研究为肿瘤免疫治疗新策略提供实验依据、临床基因治疗提供调控手段、脑胶质瘤等恶性肿瘤探索新的治疗方法。

嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）是基于肿瘤“免疫编辑”理论的一种免疫治疗新策略，它将抗体对肿瘤抗原的亲和性和T细胞的杀伤活性相结合，赋予T细胞肿瘤细胞特异性杀伤，同时，克服肿瘤局部免疫抑制微环境，改善宿主免疫耐受状态。然而，这种“超自然”T 细胞的调控是临床基因和细胞治疗需要解决的关键问题。利用自杀基因调控基因修饰的细胞是基因治疗的安全措施之一。Caspase9是细胞凋亡信号通路上天然存在的人类蛋白，无免疫原性，通过化学诱导二聚化（CID）模式将其激活、启动细胞凋亡，可调控基因修饰的细胞。FKBP12（FK结合蛋白-12）作为CID在一些基因治疗中得到有益的尝试。本研究设计FKBP12诱导的自杀基因Caspase9作为安全开关，建立可调控的T细胞模型（iCasp9），体外试验获得T细胞条件消融相关数据，为基因修饰 T细胞免疫治疗提供安全保障。首先，构建iCaspase9表达载体：FKBP12 (321bp，删除了效应区）和Caspase9 (846bp，删除了内源激活区和蛋白招募区）以linker 连接后克隆入pCDH-CMV-MCS-EF1-puro（命名为piCasp9）；然后，制备iCasp9慢病毒，转导Jurkat T细胞，puromycin筛选稳定表达的抗性细胞；Western blot鉴定iCasp9稳转细胞。体外试验证实CID（AP20187）能够诱导iCasp9-Jurkat T细胞凋亡。MTT法试验显示不同浓度AP20187（0,5,10,50,100nM）下，细胞存活率逐步下降，证明了剂量依赖性细胞凋亡；Annex V染色-流式细胞法检测显示10nM AP20187处理iCasp9-Jurkat T细胞后，细胞发生时间依赖性凋亡。本研究利用iCasp9 建立可调控细胞模型为基因/细胞治疗提供了实验依据。