靶向TRAIL-R1嵌合抗原受体T细胞有效治疗实体肿瘤的应用基础研究

Chimeric antigen receptor (CAR) T cells have achieved great success in the clinical trial of hematologic malignancies, but progress of solid tumors remains to be a breakthrough. Previous research we developed unique human monoclonal antibody technology ；Using the technology we generated agonistic monoclonal antibodies against human TRAIL-R1(TR1 Abs) ,which can induce TRAIL-R1-mediated the apoptosis of tumor cells .Further, we developed specific TCR gene therapy . And we also constructed a chimeric antigen receptor for TRAIL-receptor 1 (TR1-scFv-CAR). We found TR1-scFv-CAR-modified immne cells(T or NK cells) can induce apoptosis in various types of tumor cells.In the project ,our aims are : (1) to study the effect of TR1-scFv-CAR-T cells on solid tumor in vivo and in vitro and their mechanisms; (2) to investigate the subtypes of TR1-scFv-CAR-T cells (Tn/Tm/Te) proliferation, differentiation and apoptosis mechanisms, clarifing the CAR-T cell phenotype and persistence in vivo affecting on T cell killing functions (effectiveness factor); (3) to establish the control stratgies for CAR-T cell therapy resulting in the off target effects and antineoplastic inflammatory reaction and other serious side effects (safety). TR1-scFV-CAR-T cells can redirect target cells and activated apoptosis signal mediated by TR1 to kill tumor cells. They will are expected to breakthrough in immunotherapy of solid tumors. So far similar reports remain to be published .

嵌合抗原受体（CAR）T细胞在血液肿瘤临床治疗取得巨大成功，但在实体瘤治疗尚有待突破。我们前期研究开发了高效人源单抗制备技术,并利用该技术制备了能诱导肿瘤细胞凋亡的全人源抗人TRAIL-R1（TR1）激动性单抗；开展了特异性TCR基因治疗研究；并首次构建靶向TR1的CAR，发现TR1-CAR-T细胞兼有重定向肿瘤部位杀伤靶细胞和通过TR1介导活化凋亡信号的双重抗肿瘤作用。本研究拟进一步开展（1）TR1-scFv-CAR-T细胞对实体肿瘤体内杀伤作用及其作用机制研究；（2）探讨TR1-scFv-CAR-T细胞表现型（Tn/Tm/Te）增殖，分化和凋亡机制，阐明CAR-T细胞亚群在体内持久性与功能性的关系（有效性决定因素）；（3）探讨CAR-T细胞治疗的脱靶效应和抗肿瘤炎性反应等毒副作用，建立有效的的防治策略（安全性），为CAR-T细胞在实体瘤的临床应用提供研究基础。目前尚未见其他文献报道。

前期研究制备了靶向肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体1（TRAIL-R1）的全人源单克隆抗体，其能诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无明显毒副作用。其中，TR1-419抗体具有特异性诱导细胞凋亡作用，并明确分析了TR1-419抗体的表位由5个氨基酸组成。因此，本项目以人源单克隆抗体TR1-SCFV为基础构建了二代、三代和四代嵌合抗原受体（CAR），并探讨CAR修饰的T细胞对表达TRAIL-R1的肿瘤细胞的杀伤作用。首先通过生物信息学证实了大多数肿瘤组织高表达TRAIL-R1以及疾病预后关系；并使用改造的鼠TR1-419抗体，利用免疫组化（IHC）检测甲状腺癌、食管癌、结肠癌、胰腺癌、肺鳞癌、肺腺癌、乳腺癌均比其癌旁组织高表达，甲状腺癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌的肿瘤组织比癌旁表达更高的TRAIL-R1，适合于后期候选的靶向治疗癌种类型。.然后，建立成熟的慢病毒转染方式，为CAR-T细胞制备提供相关技术。比较了几代CAR-T在杀伤性、抗原敏感性、持续性方面的差异，揭示了TR1419-28ζCAR对靶抗原的敏感性最高； TR1419-28 BBζCAR的增殖最好，PD-1表达最高。为了验证CAR-T细胞对患者肿瘤更真实的杀伤作用，我们建立来自患者组织的肿瘤类器官，并验证CAR-T杀伤性。最后，本课题设计的CAR除了通过T细胞介导杀伤，还可以通过DR4（TRAIL-R1)）介导肿瘤凋亡，并且通过激活Caspase3/7活化验证凋亡机制。后续进一步优化了CAR-T结构，使其能分泌PD-1的单链抗体或反向改造PD-1的胞内结构，从而改善了CAR-T的存活。此课题研究阐述了构建的二和三代CAR-T的优劣并进一步优化了CAR结构，为临床CAR-T治疗提供了研究基础和技术平台。