新型溶瘤腺病毒介导IL-33的细胞内表达靶向肿瘤治疗的研究

Oncolytic immunotherapy is one of the hottest fields of current cancer treatment by combining oncolytic virus and immunotherapy. Due to high security, fast replication, easy to engineer and high stability etc, adenovirus becomes the first alternative vector for oncolytic virotherapy. The oncolytic adenovirus constructed by genetic engineering can selectively replicate in tumor cells, and lower its toxicity to normal cells, making them to become a great potential for the study. In previous study, we constructed the recombinant oncolytic adenovirus AD55-MnSOD with the deletion of E1B 55kD and the control of AFP promoter had showed the significant antitumor effects both in vivo and in vitro. To explore the application of adenovirus in oncolytic immunotherapy and further improve the targeted therapy effect of oncolytic adenovirus, this project intends to design a new oncolytic adenovirus vector targeting new tumor marker LGR5, and construct a targeting oncolytic adenovirus OncoAd-LP-IL33 by carrying new truncated immune cytokine IL-33(S109-I266) expressed in tumor cells to exert the synergic antitumor effect, and explore the oncolysis potential and anti-tumor immune mechanism. The findings will provide the theoretical and experimental basis for the application of our oncolytic immunotherapy.

溶瘤免疫疗法联合溶瘤病毒和免疫治疗是当前肿瘤治疗的热点之一。腺病毒具有安全性高、复制快、易操作和稳定性高等优点，成为溶瘤病毒治疗首选的载体。利用基因工程对腺病毒基因组进行改造，使其选择性地在肿瘤细胞中复制，降低对正常细胞的毒性，成为具有很大潜力的研究对象。在前期研究中，我们构建了甲胎蛋白AFP启动子调控的缺失E1B 55kD的重组溶瘤腺病毒AD55-MnSOD，体内外研究均显示了显著的抗肿瘤效果。为探索腺病毒在溶瘤免疫疗法中的应用，进一步提高溶瘤病毒的靶向治疗效果，本项目拟设计新型靶向肿瘤标志物LGR5的溶瘤腺病毒载体，并利用其携带新型截短免疫细胞因子IL-33(S109-I266)在肿瘤细胞内表达，构建具有协同作用的靶向性溶瘤腺病毒OncoAd-LP-IL33进行肿瘤治疗的研究，探索其溶瘤和抗肿瘤免疫的潜质和机制，为我国溶瘤免疫疗法的应用提供理论依据和实验基础。

溶瘤免疫疗法联合溶瘤病毒和免疫治疗是当前肿瘤治疗的热点之一。腺病毒因具有安全 性高、复制快、易操作和稳定性高等优点，成为溶瘤病毒治疗首选的载体。我们先构建了携带IL-33基因的溶瘤腺病毒ZD55-IL-33，通过细胞实验证实ZD55-IL-33对小鼠黑色素瘤细胞株B16-F10和小鼠乳腺癌细胞株4T1具有显著的细胞毒性。为进一步提高溶瘤病毒的靶向治疗效果，探索腺病毒在溶瘤免疫疗法中的应用，构建一种新型靶向LGR5的溶瘤腺病毒系统 OncoAd-LP，既利用LGR5启动子控制病毒E1A基因使其靶向LGR5阳性肿瘤细胞，同时联合溶瘤腺病毒和 IL-33两者的优势，利用OncoAd-LP携带N端融合有CD8α链信号肽序列的截短型 IL-33(S109-I266)表达框，获得新型靶向LGR5的重组溶瘤腺病毒OncoAd-LP-IL-33，开发IL-33作为免疫细胞因子的抗癌功效，阐明OncoAd-LP-IL-33溶瘤免疫疗法联合抗癌机制。研究结果显示，肝癌样本中LGR5阳性高表达而IL-33呈现低表达，而在癌旁正常组织中则反之。相比正常对照细胞，OncoAd-LP-IL-33 病毒处理肝癌细胞有更明显的凋亡现象，这说明我们构建的OncoAd-LP-IL-33 病毒具有肿瘤靶向性。同时随着病毒剂量的增多，PARP,Pre-caspase3,Pre-caspase9 蛋白依次减少。对OncoAd-LP-IL-33在体内的抗肿瘤效果进行评估，PBS 组肿瘤体积生长最迅速，OncoAd-LP-EGFP, OncoAd-LP-IL-33 处理组瘤体生长速度均明显减慢。此外，与 OncoAd-LP-EGFP 对比，OncoAd-LP-IL-33 可以有效的延长肝癌小鼠的生存时间。本项目联合溶瘤腺病毒和IL-33两者的优势，获得新型靶向LGR5的重组溶瘤腺病毒OncoAd-LP-IL-33，开发IL-33作为免疫细胞因子的抗癌功效，阐明 OncoAd-LP-IL-33溶瘤免疫疗法联合抗癌机制，将加快我省的溶瘤病毒药物的产 业化，促进我省的科技和经济发展，具有重要的理论和实践意义。