光下高产氢衣藻突变体的蛋白质分子基础

Hydrogen gas (H2) represents one of the clean fuel for the future. H2 photoproduction by green algae such as Chlamydomonas reinhardtii is an attractive approach to producing H2 though splitting of water using visible light. However, molecular regulation mechanism of the process is currently not fully understood. Previous studies revealed characteristics of hydrogenases catalyzing the reaction of H2 formation as well as the distinct phases of the process, but protein factors known to be involved in the regulation of the metabolic pathways are still limited. In this project, we make use of a mutant stain (Cr91) of C. reinhardtii, which yields significantly high-H2 -photoproducing phenotype, and characterize its biochemical features using comparative proteomics at cellular and subcellular levels. The specific gene will be cloned and the proteins related to the phenotype will be identified by iTRAQ MS. Experimental data obtained from the research would provide novel sights in terms of the molecular mechanism and valuable gene targets for further bioengineering toward potent strains in large-scale application.

氢气是最好的清洁燃料。绿藻光合产氢是获取氢气的有效途径，但其分子调控机理还不清楚。过去的研究使人们对催化产氢反应酶类及主要过程有所了解，但对起调控作用的因子发掘不足，限制了人们对调控分子机理的认识。因此，本项目采用分子遗传学与定量蛋白质组学相结合策略，从衣藻中发掘产氢调控新基因并研究其功能。首先，从已获得的高产氢衣藻突变体Cr91切入，分离相关基因并进行功能预测。其次，采用已优化的产氢细胞叶绿体及类囊体膜分离纯化等技术，获得不同产氢阶段野生型和突变体上述亚细胞和细胞可溶性组分，并进行蛋白及膜复合体分离。在此基础上，利用目前最灵敏的定量蛋白质组学技术iTRAQ-MS等进行质谱分析，获得与高光合产氢表型相关蛋白数据库及编码基因的完整信息，揭示新基因影响产氢效率的蛋白质分子基础。研究成果不仅有助于加深对绿藻光合产氢分子调控机理的认识，对发掘更多的产氢调控新基因、构建高光效产氢藻株也有重要意义。

氢气是最理想的清洁燃料，藻类光合产氢是利用太阳能进行清洁可持续生产氢气的重要途径。本项目以光合产氢的模式藻种莱茵衣藻为材料，从自主创建的超高放氢突变体hpm91（hydrogen production mutant 91）入手，对其高产氢的动力学特征和生理生化特性以及蛋白质分子基础进行了研究。获得了如下主要发现和结果：1）确认了hpm91是目前本领域产氢量最高的衣藻突变体（产氢量可达野生型30倍以上，可持续产氢25天）；2）分子遗传学分析表明hpm91为质粒单拷贝插入突变体，其5号染色体上包括Pgr5在内的四个基因被删除; 3)基因互补实验发现hpm91的高产氢表型是由PGR5蛋白缺失引起的; 4)产氢生理学实验发现缺硫产氢过程中hpm91与野生型的放氧和呼吸速率没有明显差异；5）对淀粉含量进行测定，发现缺硫产氢过程中hpm91淀粉的积累量与野生型相同，淀粉降解速率低于野生型，表明间接途径对hpm91产氢的贡献小于野生型；6）外加DCMU抑制PSII电子传递，发现hpm91产氢的电子主要由PSII供应；7）对产氢条件下的光合膜蛋白复合体进行蓝绿温和凝胶电泳(BN-PAGE)和免疫印迹分析，发现hpm91的光合系统比野生型更稳定；8）氯霉素处理证实hpm91的D1蛋白降解慢于野生型； 9) 外源活性氧试剂胁迫处理实验发现hpm91对过氧化氢和叔丁基过氧化氢的抗性强于野生型；10）测定产氢条件下细胞活性氧清除系统相关酶的活性，发现hpm91的酶活性高于野生型；11）定量蛋白质组学研究发现了数千个蛋白的丰度在缺硫产氢过程中发生了显著变化，进一步的大数据分析有助于加深层次地揭示该突变体产氢的代谢网络调控机制，为高光效高产氢藻株构建提供更多可利用的基因靶标。