羊痘病毒N1蛋白对宿主细胞凋亡、NF-κB和IRF3信号通路调控作用的研究

Sheep and goat pox are currently the most severe and economically devastating livestock poxvirus infections. It is necessary to further strengthen the researches on mechanisms of viral infection and pathogenesis. Orthpoxvirus N1 protein could simultaneously inhibit the host apoptosis, NF-κB and IRF3 signalling pathways, thereby play a curial role in the process of viral evasion of the host immune system. We had already showed that goatpox virus (GTPV) encoding N1 homolog (gp135) also had 7 conservative α-Helix structures of Bcl-2 like poxviral protein family. To explore the characteristic and bio-functions of GTPV N1 protein, JC-1 mitochondrial membrane potential assay, Annexin V-FITC assay, dual luciferase reporter gene assay and co-immunoprecipitation will be adopted in this study to investigate the regulations and possible mechanisms of GTPV N1 on host apoptosis, NF-KB and IRF3 signalling pathways in vitro. Finally, goat will be inoculated with N1 knockout recombinant GTPV, in order to investigate the real effect of N1 protein on viral pathogenicity and immunogenicity in vivo. This study will facilitate to uncover the mechanisms of infection and pathogenesis of capripoxvrius, and shed new insights for the development on control strategy and novel capripoxviruses based live vector vaccines.

羊痘是当前危害最为严重的家畜痘病毒病，迫切需要加强对羊痘病毒感染致病机制的研究。正痘病毒编码的N1蛋白同时具有抑制宿主细胞凋亡、NF-κB和IRF-3信号通路的能力，在病毒突破宿主免疫防御过程中发挥重要作用。本课题组前期发现羊痘病毒gp135蛋白与正痘病毒N1蛋白同源，同样具有Bcl-2样痘病毒蛋白家族成员保守的7个α-螺旋结构，提示其可能具有与正痘病毒N1蛋白相似的生物学活性。本课题拟采用JC-1染色流式细胞术、Annexin V法、双荧光素酶报告基因检测法和免疫共沉淀法等手段，首先在体外条件下研究羊痘病毒 N1蛋白对宿主细胞凋亡、NF-κB和IRF-3信号通路的调控作用并探讨其机制。进一步构建N1蛋白缺失重组病毒并接种山羊，以考察N1蛋白在体内条件下对病毒致病力和免疫原性的真实影响。本课题将有助于阐明羊痘感染过程中病毒与宿主相互作用机制，为羊痘的防控及新型活载体疫苗的研究提供新的思路。

羊痘是当前危害最为严重的家畜痘病毒病，迫切需要加强对羊痘病毒感染致病机制的研究。正痘病毒编码的N1 蛋白同时具有抑制宿主细胞凋亡、NF-κB 和IRF-3 信号通路的作用，在病毒突破宿主免疫防御过程中发挥重要作用。前期发现山羊痘病毒（goatpox virus, GTPV）gp135蛋白与正痘病毒N1 蛋白高度同源，同样具有Bcl-2 样痘病毒蛋白家族成员保守的7 个α-螺旋结构，提示其可能具有与正痘病毒N1蛋白相似的生物学活性。本研究首先采用RT-PCR研究GTPV N1L基因的转录动力学证实其为痘病毒早晚期转录基因；构建表达GTPV N1L基因的报告质粒pGN1-EGFP转染Vero细胞，通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜检测证实N1蛋白分布在胞浆中。制备稳定表达N1蛋白的Hela细胞克隆，构建N1L基因缺失重组病毒rGTPV△N1L和N1L基因恢复重组病毒rGTPV N1R，采用Hoechst 33342染色、Annexin V : FITC 染色、双荧光素酶报告基因检测、免疫共沉淀和TUNEL原位检测等手段，在体外条件下证实GTPV N1 蛋白能抑制宿主细胞凋亡，以及NF-κB和IRF-3 信号通路活化，而且发现N1蛋白能与宿主细胞TBK1结合但不能与细胞内源性Bax结合。建立一个基于弱毒疫苗毒株，涵盖临床观察、病理学检查、原位细胞凋亡及炎症检测、细胞因子转录水平检测、抗体和细胞免疫测定等完整的病毒动物体内评价技术体系，破解山羊痘病毒生物学特性和致病机制研究缺乏理想动物体内研究技术平台，而强毒研究需要高等级生物安全实验室的难题。借助该平台开展了重组病毒的致病性和免疫原性研究，证实rGTPV△N1L较亲本毒株的致病性更低，但免疫原性基本保持不变。相关成果有助于阐明羊痘感染过程中病毒与宿主相互作用机制，为羊痘的防控及新型活载体疫苗的研究提供新的思路。