羊痘病毒宿主范围因子对干扰素信号通路调节作用的研究

痘病毒宿主范围因子（Host range factor，Hrf）能对机体抗病毒通路进行调节，为病毒的增殖提供适宜的细胞微环境。羊痘病毒是重要的动物痘病毒之一，其Hrf的研究在国内外尚属空白。通过对羊痘病毒的全基因组分析发现有一与痘苗病毒Hrf 的E3L同源的蛋白，该蛋白具有双链RNA结合域，提示它可能对双链RNA诱导的干扰素信号通路起调节作用。本课题拟用同源重组方法筛选羊痘病毒E3L同源基因缺失株，通过检测突变株对IFNs诱导的双链RNA依赖的蛋白激酶（PKR）信号通路的关键蛋白的磷酸化水平和2'-5'寡腺苷酸合成酶(2'-5'OAS)活性的影响，研究羊痘病毒Hrf在抗干扰素信号通路中的作用。本课题为阐明宿主和羊痘病毒之间的抗病毒和抗病毒抑制的关系，深入理解病毒与机体的共进化关系有重要的意义，为新型疫苗的研制提供理论基础。

宿主范围因子（host range factors，Hrfs）是病毒在长期进化过程中形成的一类能特异性地针对宿主抗病毒信号通路的蛋白，Hrf的缺失或突变能抑制痘病毒在某一类细胞中的增殖。为研究绵羊痘病毒E3L对PKR介导的抗病毒信号通路的调节作用，我们做了以下研究工作：1）建立了针对E3L基因的实时定量PCR方法，其特异性好，能明确区别绵羊痘病毒和羊接触传染性脓疱性皮炎病毒；敏感性强，可检测到102 copies/μL的SPPV；重复性高，变异系数小于5%。2）制备了羊痘病毒E3L的多克隆抗体，可用于下游试验中对绵羊痘病毒的E3L表达含量变化的检测。3）通过IFA方法对感染Vero细胞的绵羊痘病毒表达的E3L进行定位，结果显示E3L定位在细胞质中。4）绵羊痘病毒E3L对PKR作用活性探究。用浓度范围 0～5000 U/mL的人的IFN-β处理绵羊痘病毒感染的Vero细胞，待0 U/mL IFN-β处理的细胞孔完全病变时，用建立的SPPV qPCR的检测方法对病毒拷贝数进行测定，结果显示100 U/mL的IFN-β即可明显地抑制SPPV的复制，说明SPPV对IFN-β敏感。用pcDNA3.1(+)-SPPV E3L质粒转染Vero细胞，48 h后分别用浓度为10、20、50 µg/mL的polyI:C转染细胞刺激PKR的活化，8 h后用RIPA裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白进行Western-blot检测，结果显示随着polyI:C浓度的增加，细胞内PKR的磷酸化水平逐步提高，而SPPV E3L蛋白的表达对这一过程无显著影响，表明SPPV E3L蛋白在体外试验中不能抑制PKR的磷酸化。用生物信息学软件对SPPV E3L结构进行分析发现，该蛋白包含类似痘苗病毒E3蛋白的Z-alpha和DSRM两个保守功能域，其中DSRM具有结合dsRNA的能力。氨基酸分析显示DSRM结合dsRNA的能力主要由E124、F135、F148、G164、K167、R168、K171和A174位氨基酸残基决定，与痘苗病毒的E3相比，绵羊痘病毒的该蛋白的135、168和174位残基发生F→I、R→K和A→S的突变，这可能是SPPV E3L无法抑制PKR活化的原因。本试验结果表明，羊痘病毒的E3L可能不是病毒的宿主范围因子，在对抗细胞干扰素信号通路中没有发挥作用。