UTMD介导携TIMP-1干细胞治疗AMI及其疗效评价的实验研究

Mesenchymal stem cells (MSCs) transplantation is a very promising method to treat acute myocardial infarction(AMI) and has gained significant attention now days. However, little effect of it on AMI. Therefore, novel approaches are needed to augment the efficacy by which transplanted MSCs enhance cardiac repair in order to optimize cardiac regain of function following cell transplantation therapy. Research have showed that tissue inhibitors of metalloproteinase-1(TIMP-1) is innate protease inhibitors of matrix metalloproteinases(MMPs), which play a fundamental role in the degradation and aberrant production of ECM proteins. We want to transfect MSCs with TIMP-1, an antiapoptotic and antifibrotic gene, transplant them into the myocardium post-MI, and evaluate their effects on cardiac myocyte engraftment and differentiation, myocardial remodeling and cardiac function. We plan to:①combine ultrasound microbubbles with cationic nanoliposomes by biotin-avidin system and prepare a new type of gene vector. Use ultrasound-targeted microbubble destruction (UTMD) to increase the permeability of capillaries, so that it can mediate transfection of MSCs with TIMP-1(TIMP-1- MSCs);②inject microbubbles and TIMP-1- MSCs cells to the ischemic cardiac region in the AMI animal model through the tail vein. Promote stem cells homing by UTMD, so that they can over-express TIMP-1, following transplantation into the infracted myocardium. It will increase angiongenesis and new myocardium formation, and attenuate ventricular remodeling by inhibiting both interstitial and vascular fibrosis;③ Left ventricular configuration and myocardial function after treatment was evaluated using high resolution ultrasound biological microscope technique.

基因修饰的干细胞移植治疗急性心肌梗死(AMI)效果显著，由于缺乏安全高效的基因传递系统，临床运用受限。研究表明，金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP -1)通过抑制基质金属蛋白酶家族(MMPs)表达，具有抗细胞凋亡和抗心肌纤维化的作用。本研究尝试用超声微泡-基因-细胞传递体系，对干细胞移植治疗中的关键问题进行有意义的探索：拟①制备携TIMP-1超声微泡-阳离子纳米脂质体复合物，将TIMP-1转染入骨髓间充质干细胞(MSCs)；②经静脉注射混合了超声微泡的基因修饰MSCs(TIMP-1- MSCs)，以超声辐照缺血心肌，通过超声靶向微泡破坏(UTMD)促进TIMP-1- MSCs靶向归巢、分化，并通过高表达TIMP-1，抑制MMPs表达，最终达到补充心肌内有效收缩单元、减少细胞凋亡、促进新生血管生成、减少或逆转心肌纤维化的目的；③利用超声生物显微镜技术评价治疗后小鼠左室构型及心肌力学特征。

金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP -1)可抑制基质金属蛋白酶家族(MMPs)表达，可抑制心肌梗死过程中的细胞凋亡和心肌纤维化。因此，通过基因转染提高TIMP -1表达，可用于治疗急性心肌梗死。然而目前仍缺乏安全有效的体内基因转染方法。超声靶向微泡破坏(UTMD)技术作为一种介导基因转染的方式，已经被广泛应用于基础研究。利用超声击破微泡产生的声孔效应，使细胞膜通透性增加，促进更多的药物或者基因进入胞浆。阳离子脂质微泡(CMB)是超声微泡的一种，由于其表面电荷作用，可与携带目的基因、呈负电荷的质粒结合，在超声靶向击破下，携带的基因可在心脏局部释放，进入心肌细胞，提高基因表达。. 本研究通过薄膜水化法制备了阳离子微泡，微泡浓度(2.65±0.3)×109/ml，粒径 (1680.1±118)nm，电位(32.39±2.53)mV，具有较好的体内及体外的显影能力，且对细胞及组织均无毒。阳离子微泡可以携带目的基因的质粒结合，5×108个CMB结合质粒的饱和量（17.23 ± 0.31 µg）。将携带质粒的阳离子微泡体外与骨髓间充质干细胞（MSC）共孵育，超声辐照后24h后，荧光显微镜下观察发现质粒+UTMD组荧光基因表达最强，而单纯质粒组未见明显荧光基因表达。说明UTMD联合阳离子载基因微泡，可显著提高基因的转染效率。制备小鼠急性心肌梗死模型，利用UTMD介导阳离子载基因微泡体内转染心肌。活体荧光成像发现，UTMD联合载基因阳离子微泡组小鼠心脏的荧光强度显著高于单纯质粒组及对照组，而单纯质粒组与对照组心脏部分均没有明显荧光基因表达，说明UTMD显著增强基因在心脏中的转染效率。另外，小鼠身体其他部位未见明显荧光信号，说明UTMD的靶向性可显著降低外源基因对身体其他部位的影响。超声心动图检查也证实UTMD联合载基因阳离子微泡组小鼠的左室射血分数和缩短率均高于另外两组。进一步研究发现，UTMD联合载基因阳离子微泡组心肌组织中TIMP-1表达显著增高，同时MMP-2显著降低。说明基因转染可抑制基质金属蛋白酶对心肌的损伤，保护心肌功能。. 本研究构建了载TIMP-1基因的阳离子微泡，体外、体内实验均证实UTMD介导载基因微泡，可显著提高基因的转染效率，抑制基质金属蛋白酶表达，保护心肌功能。本研究有望为基因转染治疗心梗提供新思路。