ATG3/ATG7基因缺陷型免疫细胞对自身免疫性葡萄膜炎的调控作用及其机制的研究

Uveitis is a blind-causing disease, among which the autoimmune uevitis (AU) is the most common type. Autophagy is crucial for cellular physiological function and closely related to the autoimmune diseases. Currently little is known for the role of autophagy in AU. This project aims to establish two types of experimental AU (EAU), namely, Atg3- and Atg7-defficiency knock-out mice EAU model and autophagy-defficiency naïve CD4+T/bone marrow moncyte (precursor of macrophage and dentric cell) infusion model. Based on the two models, the role of autophagy-deffeciency immunocytes in AU and molecular mechanism are investigated. Our primary data suggested： (1) Mice treated with autophagy-deffeciency immunocytes were more vulnerable to EAU with higher amount of Th17 cells; (2) Vivo data showed autophagy-deffeciency CD4+T cells were inclined to differentiation to Th17 cells and autophagy-deffeciency macrophages could synthesize more IL-23. Therefore, we speculate the potential mechanism that more autophagy-deffeciency immunocytes differentiate to Th17 cells and synthesize more IL-23, hence promote inflow of Th17 to cells and consequently exaggerate the EAU. This work will validate the aforementioned speculation, particularly the key modulation function of autophagy regarding Th17/IL-23, hence be helpful to unveil the role of autophagy in AU.

自噬是细胞关键的自稳机制，与自身免疫疾病密切相关，但在自身免疫性葡萄膜炎（AU）中作用尚不清楚。本项目利用两种实验性AU(EAU)模型：自噬基因缺陷型（Atg3/Atg7条件性敲除）小鼠和自噬基因缺陷免疫细胞（ADIC）（naiveCD4+T细胞和骨髓单核细胞）输入性小鼠模型，研究ADIC及相关细胞因子在AU发病中作用机理。前期预实验数据显示：1）含ADIC小鼠较野生型小鼠更易诱导EAU，其眼内含更多Th17细胞；2）体外实验表明自噬基因缺陷型CD4+T细胞更易向Th17细胞分化，自噬基因缺陷型巨噬细胞合成更多IL-23。据此提出假说：ADIC分化出更多Th17细胞并合成更多IL-23，共同促进Th17细胞进入眼内，进而加重EAU。本项目将验证上述推测，明确其中起关键作用的免疫细胞及细胞因子，深入探讨自噬对IL-23/ Th17细胞这一核心环节的体内调控作用，揭示自噬在AU中的关键分子机制

自噬是维持生命稳态的高度保守过程，其功能失调与大多数自身免疫病的发生发展密切相关，而自噬在自身免疫性葡萄膜炎中的作用和机制尚不清楚。免疫细胞是导致自身免疫性葡萄膜炎的关键细胞，因此我们构建不同类型免疫细胞自噬缺陷的小鼠模型用于实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)研究。T细胞自噬缺陷、巨噬细胞自噬缺陷以及树突状细胞自噬缺陷的小鼠均表现出较野生型小鼠更严重的EAU症状，其中以T细胞自噬缺陷小鼠表现最为明显，而B细胞自噬缺陷小鼠的EAU严重程度与野生型小鼠无明显差别。我们重点研究T细胞自噬缺陷小鼠的EAU模型，发现自噬缺陷的T细胞更易向Th17细胞分化，而且体外对naive CD4+T细胞的Th17分化诱导亦支持了这一结论。.分子机制研究发现，Th17细胞信号转导通路检测显示STAT3总蛋白以及磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白的明显降解，而自噬基因敲除或使用自噬抑制剂促进这两者蛋白积累，蛋白酶体抑制剂则无明显作用。同时在IL-6刺激的HEK 293T细胞内观察到相似的p-STAT3降解。在293T细胞中通过对多个自噬接头蛋白的筛选，发现p-STAT3特异性结合OPTN，在Th17细胞内亦证实这两者的内源性结合。干扰OPTN表达能明显抑制p-STAT3降解以及Th17细胞分化。这些结果表明自噬通过接头蛋白OPTN特异性募集磷酸化STAT3至自噬体降解，从而负调控Th17细胞的分化和EAU的发生发展。更重要的是，rapamycine体内注射则可以明显减少Th17细胞分化，并延缓EAU的病程发展。该研究结果明确了自身免疫病EAU发病机制中的自噬调控作用，为临床自身免疫性葡萄膜炎的预防和治疗提供新的靶点。