杨树ERF转录因子耐盐调控机理研究

Poplars, characteristic of wide distribution, strong adaptability, and fast growth,are an important afforestation tree species, as well as a green tree species. However, the growth and development of poplars have been greatly affected by the shortage of water resources and soil salinization. In order to cultivate new resistant varieties of poplar, a lot of resistant genes have been used in poplar transformation. But a single functional gene makes the resistance of transgenic poplars not ideal. Therefore, cloning of stress responsive genes encoding transcription factors from poplars, followed by development of transgenic poplars, are hypothesized to change significantly the endogenous gene expression profile for stress resistance. On the basis of isolation of the gene encoding the ERF transcription factor and transgenic poplars transformed by ERF transcription factor gene, the mechanisms underlying ERF regulation for salt-resistance will be systematically examined. First, the ERF protein binding capability with the cis-acting element GCC box and corresponding transcriptional activation will be characterized. Then, target genes of the ERF transcription factor will be identified, followed by gene functional analysis and biological pathway studies. Finally, interactions of the ERF transcription factor with other proteins will be investigated, in order to understand transcriptional efficiency. These multiple -level studies will help clarify the mechanisms underlying the regulation of salt-tolerance by the ERF transcription factor in poplars.

杨树分布广、适应性强、生长速度快，是我国重要的造林和绿化树种。但在水资源缺乏、盐渍化严重的地区，杨树的生长发育受到影响。为培育杨树抗逆新品种，大量抗逆基因用于杨树遗传转化，但单一的功能基因使得转基因杨树的抗逆效果并不理想。克隆杨树应答逆境胁迫的转录因子基因，对其进行遗传转化，将提高转基因杨树内源抗逆相关基因表达，解决以往杨树转基因中单一基因抗逆性提高不明显的问题。本研究拟在分离杨树耐盐ERF转录因子基因基础上，对其调控的抗盐机制进行系统地研究。首先，研究ERF转录因子与GCC box等顺式作用元件的结合，明确其转录调控功能；其次，研究ERF转录因子与其他蛋白质的互作，了解互作对转录激活的影响；最后，鉴定ERF转录因子调控的下游靶基因，分析这些基因产物参与或调节的代谢过程，阐明ERF转录因子的分子生物学功能。通过以上不同层次的研究，系统地阐明ERF转录因子在杨树抗盐过程中的作用机制。

ERF转录因子是植物特有的一类转录因子，在植物生长发育和逆境胁迫反应中发挥重要作用。本研究在分离杨树ERF转录因子基因基础上，对ERF转录因子调控的耐盐机制进行研究。首先，利用酵母单杂交法对ERF转录因子与GCC box顺式元件的相互作用进行研究，结果表明杨树ERF转录因子可与GCC-box 顺式元件发生互作；GCC-box 顺式元件核心序列中第5位G、第7位C发生突变时，杨树ERF转录因子不能与突变后的GCC box发生互作，顺式元件个别碱基突变影响下游基因的转录。其次，利用酵母双杂交法筛选与ERF转录因子发生互作的蛋白，结果表明杨树ERF转录因子可与蔗糖半乳糖转移酶2、衰老相关蛋白、磷脂酶C家族蛋白、MLP类蛋白、功能未知蛋白发生互作；ERF转录因子磷酸化位点突变影响蛋白质间的相互作用；Real-time PCR检测结果表明盐胁迫可诱导互作蛋白基因和ERF基因的表达，ERF及其互作蛋白可能在植物抵御逆境胁迫的过程中，协同发挥作用。最后，利用农杆菌介导法获得27个ERF基因过量表达转基因小黑杨无性系。在盐胁迫条件下，转ERF基因杨树株高、鲜重、POD活性、SOD活性均高于非转基因植株，而转ERF基因杨树MDA含量低于非转基因植株。ERF基因过量表达可以促进转基因杨树的生长，提高转基因杨树的耐盐能力。RNA-Seq测序结果表明杨树ERF转录因子作为中心调控器，调控植物体内防御相关蛋白、氧化酶类、胁迫应激蛋白、蛋白激酶等相关基因的表达，协同作用促进转基因植株的生长，提高转基因植株的耐盐能力。通过以上不同层次的研究，初步阐明ERF转录因子在杨树盐应答过程中的作用机制，为杨树ERF转录因子耐盐调控机理的深入研究提供实验依据，同时也为ERF转录因子在杨树抗逆分子育种中的应用提供参考。