杨树转录因子ERF76基因功能分析

Transcription factor ERF76 gene from poplar belongs to ERF transcription factor gene family, and its expression is induced by stress. For the understanding of the molecular biological of transcription factor ERF76 gene function in poplar, the studies will be performed as following. First, to cultivate the transgenic poplar of overexpression and inhibit expression of transcription factor ERF76 gene, and analyze the changes of the morphological trait, physiological characteristics, and the resistant ability against drought and salt; Second, to analyze the DNA sequences bound by transcription factors ERF76 using Chip-Seq method, to identify the downstream target gene regulated by transcriptional factor ERF76 with poplar transcriptome sequencing, to analyze the metabolic processes involved in or regulated by these gene products; Third, to detect the binding capacity of transcription factor ERF76 protein with the GCC-box, DRE and CRT and other cis acting elements, and the interaction between the transcription factor ERF76 and other proteins, to clear its transcriptional regulation functions and the effects of different protein on transcriptional activation ability; Fourth, to detect the differentially expressed proteins between transgenic lines and non transgenic lines using iTRAQ method, to confirm each other with transcriptome sequencing results. Through the different levels of the study, to clarify the mechanism of transcription factors ERF76 in the process of growth, development and stress resistance in poplar, to clarify the molecular biology of the transcription factor ERF76 function.

杨树转录因子ERF76基因属于ERF转录因子基因家族，是一个受胁迫诱导表达的基因。为探明转录因子ERF76基因在杨树生长发育和抗旱耐盐胁迫过程中的生物功能，本研究拟进行以下四个方面的研究：首先，培育转录因子ERF76基因过量表达和抑制表达的杨树转基因株系，分析其形态特征、生理特征和抗旱耐盐能力的变化；其次，利用Chip-Seq分析与杨树转录因子ERF76结合的DNA序列特征，结合转录组测序结果鉴定杨树转录因子ERF76调控的下游靶基因；第三，研究杨树转录因子ERF76与其下游靶基因顺式作用元件的结合能力及与其他蛋白的相互作用，明确其转录激活能力和转录调控功能；第四，利用iTRAQ方法定量分析转基因株系的差异表达蛋白质，与转录组测序确定的下游靶基因互相印证。通过以上不同层次的研究，阐明杨树转录因子ERF76在杨树生长发育和抗逆胁迫过程中的作用机制及分子生物学功能。

转录因子是以反式作用因子的形式与基因启动子序列中的顺式作用元件相结合，通过与其他相关蛋白之间的互作来激活或者抑制转录，从而调控下游靶基因的表达。AP2/ERF转录因子是植物中特有的转录因子家族，与植物生长发育和应答逆境胁迫相关。通过小黑杨叶片转录组测序筛选杨树应答盐胁迫的AP2/ERF家族基因，发现在上调表达AP2/ERF基因中，杨树转录因子ERF76基因相对表达水平最高。利用RT-qPCR分析ERF76基因在不同组织和不同盐胁迫时间表达模式，结果表明ERF76基因在根茎叶中均有表达，但在根中相对表达水平最高，依次是叶和茎，在胁迫3-36 h时间段内，该基因在根茎叶中相对表达水平达到最高的时间点均为12 h。.利用RT-PCR从小黑杨中克隆出1537 bp编码ERF76基因的cDNA片段。通过农杆菌介导的叶盘转化法获得CaMV35S启动子驱动下的ERF76基因过表达转基因转基因小黑杨。在NaCl胁迫条件下，转基因小黑杨的株高、根长、鲜重、抗氧化酶活性、抗逆境保护分子含量和相对含水量均高于非转基因株系，植物活性氧的积累和相对电导率均低于非转基因株。转基因杨树和野生型杨树具有明显的表型差异，转基因杨树中的ABA和GA相对含量明显高于野生型。转基因杨树和非转基因杨树转录组分析结果表明转基因杨树中ERF76的mRNA丰度比非转基因杨树高6.56倍。375个差异表达基因（DEGs）包括268个上调表达基因和107个下调表达基因，其中上调表达基因中包含16个转录因子基因和45个植物抗逆相关基因。.从小黑杨基因组中克隆出ERF76基因上游1.5 kb的DNA序列。元件预测结果表明，ERF76基因启动子序列中包含转录、植物胁迫应答和植物生长发育相关的顺式作用元件。利用酵母单杂交鉴定与ERF76基因启动子互作的蛋白包括转录、氧化还原酶活性、植物防御和应激反应，植物生长发育相关蛋白。利用RT-qPCR、GUS染色和GUS荧光定量检测转基因拟南芥中不同启动子片段驱动GUS基因表达情况，结果表明ERF76启动子片段具有转录激活活性和应答盐胁迫功能。表明杨树转录因子ERF76基因是一个盐胁迫诱导表达基因，在杨树生长发育和应答盐胁迫过程中具有重要作用。