生物钟核心转录因子OsPRR73调控水稻耐盐性的分子机制研究

As an endogenous time-keeping mechanism, plant circadian clock regulates many aspects of growth behavior, including both biotic and abiotic stresses tolerance. But whether and how its regulation on salinity stress is still largely unknown. Soil salinity is one of major abiotic stresses which limit crop production worldwide. Irrigating with groundwater has even intensified this problem especially for rice (Oryza sativa L.), which is a salt-sensitive crop plant. Previously, we have characterized a T-DNA insertional null mutant of OsPRR73, and found it displayed less tolerance to salt treatment. In addition, our preliminary data showed the OsPRR73 protein predominantly localizes into nucleus, in line with its transcription factor activity. In this project, we will further generate the OsPRR73 overexpressing lines and CRIPR/Cas9 lines and investigate their salt tolerance phenotype respectively. Moreover, we will conduct ChIP-seq and RNA-seq to characterize the target gene set of OsPRR73. We will characterize the selected direct target genes of OsPRR73, and further genetically validated it by epinastic analysis by crossing their CRISPR/Cas9 mutants with osprr73 mutant. Collectively, we are aiming to unravel the OsPRR73 mediated circadian output for salinity tolerance through key target genes by establishing the OsPRR73-target genes molecular module. This study will not only laid a chronobiology basis for rice salinity tolerance breeding, but also will provide the premium genetic resources for rice salt-tolerance molecular breeding.

盐胁迫是导致水稻减产的重要因素之一，生物钟调控植物对多种非生物胁迫的适应性，但目前对生物钟调控水稻耐盐性尚缺乏了解。我们前期鉴定得到了水稻生物钟关键转录因子OsPRR73基因的纯合突变体，并发现其对盐胁迫更为敏感。本项目拟深入研究OsPRR73调控水稻耐盐性的分子机制。项目将创制OsPRR73超表达和CRISPR/Cas9突变体等遗传材料，并分析它们的耐盐性；通过OsPRR73蛋白的亚细胞定位、转录活性以及生化特性分析，确定其在分子功能上作为转录因子发挥作用；结合ChIP-seq和RNA-seq多组学手段和生物信息学分析，鉴定OsPRR73调控的关键靶基因；利用EMSA，ChIP等分子生物学手段结合遗传学分析，建立“OsPRR73-盐胁迫关键基因-水稻耐盐性”这一分子模型。项目的实施将为生物钟调控水稻耐盐性提供时间生物学理论依据，也可为水稻耐盐分子设计育种提供优质遗传资源。

土壤盐渍化是一种常见的非生物胁迫，严重制约着作物产量的提高。本项目通过系统研究OsPRR（Oryza sativa Pseudo-Response Regulator）基因家族5个成员盐胁迫响应情况，发现仅有OsPRR73特异性地正向调控水稻耐盐性。在高盐环境中，T-DNA插入以及基因编辑获得的OsPRR73功能缺失突变体，在萌发、幼苗以及成熟阶段均对盐胁迫更加敏感，并且高盐的环境会导致osprr73材料产量显著降低。分析结果表明OsPRR73特异性地定位于细胞核中，转录水平受生物钟严格调控，盐胁迫能够诱导其表达上调，但并不改变其表达时相。此外，osprr73突变体材料中大部分生物钟相关基因的表达时相或表达幅度发生改变，说明OsPRR73属于生物钟的关键组分之一。转录组学数据分析结合Na+、K+含量测定结果，发现OsPRR73可能调控Na+转运。根据转录组学分析结果，结合生化实验鉴定到质膜定位的Na+转运体OsHKT2;1（High affinity K+ transporter 2;1）是OsPRR73的直接靶基因。OsPRR73直接结合OsHKT2;1的启动子上并抑制其转录，进而在时间维度控制OsHKT2;1节律性表达。然后，通过免疫共沉淀结合质谱分析OsPRR73互作蛋白组，筛选到组蛋白去乙酰化酶HDAC10（Histone deacetylase 10）与OsPRR73互作，并调控OsHKT2;1启动子上乙酰化修饰水平，进而调节染色质紧密状态。深入分析后发现OsPRR73与HDAC10的相互作用可增强对OsHKT2;1的转录抑制作用。通过基因编辑技术获得了OsHKT2;1功能缺失突变体，增强了水稻耐盐性。遗传学分析表明表明OsHKT2;1在遗传上位于OsPRR73的下游，调控Na+稳态平衡。细胞生物学分析发现在高盐环境中osprr73叶片和根中均有大量ROS积累，而耐盐较强的oshkt2;1材料中ROS积累相对较少，oshkt2;1 osprr73遗传双突材料中ROS积累也类似于oshkt2;1材料。该结果进一步说明，OsHKT2;1位于OsPRR73的遗传下游，调控细胞内ROS稳态平衡，增强水稻对高盐环境的适应性。此外，本项目研究还发现生物钟另一个核心组分复合体OsEC1调控水稻的耐盐性，研究为提高水稻耐盐性提供了理论依据和优质遗传资源。