黄瓜ERF转录因子CsERF1调控耐涝性的分子机理研究

Cucumber (Cucumis sativus L.) is easily affected by heavy rain and subsequent periods of soil flooding in summer. In previous research, the gene expression profiling of cucumber plant over a period of waterlogging treatment has been analyzed，and ethylene responsive factor was found to be involved in waterlogging response. The aim of our project was to identify the function of CsERF1. Therefore, the CsERF1 over-expression and RNAi transformation plant will be constructed. Waterlogging, waterlogging with 1-MCP, waterlogging with ethylene pretreatment will be applied to check the CsERF1, ADH、PDC、SUS gene expression. The phenotype change of the transformed plant and the wild type under thredd treatments will be checked. The contents of ethylene and auxin, and gene involved in the synthesis and signal transduction of ethylene and auxin will be analyzed by qRT-PCR. Finally, we want to find the three following points. 1) Whether the gene expression of CsERF1 was regulated by ethylene or not? 2) How does the CsERF1 regulate ADH、PDC、SUS gene expression? 3) How does hormonal interplay during the phenotype change in waterlogged cucumber plant? The outcome of this study will help us to accelerate the cucumber genetic resource innovation of waterlogging resistance, and provide new insights of ERF signal transduction mechanisms.

黄瓜根系入土浅、通气组织不发达、再生能力差，因此极易受到涝胁迫危害。前期通过数字基因表达谱筛选获得应答涝胁迫的ERF转录因子，并进一步获得了该基因参与调控黄瓜耐涝性的初步证据。本项目拟通过构建CsERF1基因的过量表达株和RNAi抑制表达株，采用涝胁迫与乙烯作用抑制剂1-MCP、乙烯作用促进剂乙烯利预处理相结合，比较转化植株和野生型之间耐涝性（涝胁迫响应标志基因和形态性状的变化）差异；分析外源乙烯对CsERF1基因及黄瓜耐涝性的影响；研究转化植株和野生型在三种处理下植物内源乙烯和生长素含量变化及相关基因的表达变化，同时结合不定根形成和根系细胞凋亡情况，阐明黄瓜涝胁迫过程中CsERF1基因诱导的形态改变与激素变化之间的联系；最终明确CsERF1基因缓解黄瓜涝胁迫的分子机制。CsERF1基因功能的解析不仅对黄瓜耐涝种质资源创新具有重要意义，也为完善ERF转录因子信号转导机制提供重要信息。

本研究针对黄瓜涝胁迫危害后的生理生化变化和分子应答机制进行解析，初步证明乙烯、生长素和活性氧信号分子协同参与黄瓜不定根形成过程，并对其调控机制进行研究。主要研究结论如下：1）黄瓜幼苗主要通过植株茎部形成不定根来缓解涝胁迫伤害。涝胁迫处理第三天，茎部产生白色根原基突起；第四天，少量根原基突起撑破表皮，形成短小的不定根；第五天时，大量的不定根形成且不断伸长。2）涝胁迫诱导不定根形成过程伴随着ROS的积累，外源H2O2可以显著促进不定根形成；ROS在不定根形成过程中的大量产生可能是由于呼吸爆发氧化酶家族基因CsRboh3和CsRboh6的上调表达和清除ROS的金属硫蛋白基因MT3被抑制表达的共同结果。3）采用乙烯合成的直接前体ACC处理结合涝胁迫处理黄瓜植株七天后，不定根的数目和长度显著增加。采用乙烯作用抑制剂1-MCP处理后，抑制了不定根的数目和长度。涝胁迫后乙烯释放量增加；ACC处理结合涝胁迫处理显著增加了乙烯释放速率，而1-MCP处理则显著抑制了乙烯的释放速率。乙烯合成酶基因CsACS4和CsACS7以及乙烯氧化酶基因CsACO1和CsACO9在涝胁迫下乙烯诱导生成过程中起重要作用。乙烯响应因子CsERF1在涝胁迫下被诱导高表达，在1-MCP预处理后被抑制表达。综上我们认为乙烯在黄瓜不定根形成过程中起到了关键的促进作用。4）采用不同浓度的生长素运输抑制剂NPA结合涝胁迫对黄瓜植株进行处理后发现，10-1000 µM的NPA处理均显著抑制了不定根的数目和长度。这说明生长素参与诱导黄瓜涝胁迫下不定根的形成。5）NPA处理抑制了黄瓜涝胁迫下的乙烯释放速率和H2O2含量，说明生长素可能促进了ROS和乙烯的产生；而ACC不能恢复DPI对不定根形成的抑制作用。综上所述，我们进一步证实了乙烯、生长素和ROS在黄瓜涝胁迫下不定根形成过程中均起促进作用，且生长素对乙烯和ROS的产生起促进作用。通过本研究，揭示了激素和ROS在黄瓜不定根形成过程中的作用，该结论为后续鉴定调控不定根形成的关键基因奠定基础，为全面系统解析黄瓜涝胁迫下不定根形成的机理提供重要线索。