百脉根AP2/ERF转录因子LcSRA1耐盐胁迫应答的分子机制

Lotus corniculatus L.is a common flowering plant native to grassland temperate Eurasia and North Africa. It is used in agriculture as a forage plant, grown for pasture, hay, and silage. High-salt stress present a major challenge in our quest for sustainable food production as it reduces the potential yields in forage plants. AP2/ERF transcription factors play an important role in plant environmental stress tole-rance by controlling the expression of many stress related genes. 131 AP2/ERF transcription factor genes were identified through global analysis of Lotus genome. Using the QRT-PCR method, one AP2/ERF gene LcSRA1 (KC777345) was strongly induced by 150 mM NaCl (LcSRA1: Salt Responsive AP2/ERF 1). Overexpression of LcSRA1 gene in Lotus corniculatus and Arabidopsis thaliana performed high salt stress tolerance. Exploring the molecular mechanism of LcSRA1 contributes to develop the salt stress-tolerant transgenic Lotus corniculatus. The objectives are: (1) Functional analysis the promoter of LcSRA1; (2) Identification the LcSRA1 promoter binding protein through yeast one hybrid method; (3) Global analysis LcSRA1 targeted gene based on RNA sequencing, identification of core element of targeted genes which is bind by LcSRA1 protein; (4) Identification LcSRA1 interacting protein which can affect the activity of LcSRA1 based on the method of yeast two hybrid and proteomics analysis. This could open an excellent opportunity to develop salt stress tolerant forage plants in the future.

土壤盐渍化对农牧业的威胁是全球性问题，AP2/ERF基因家族是重要的抗逆转录因子。本项目以百脉根"Leo"为材料，从全基因组中分离、鉴定出131个AP2/ERF转录因子，通过QRT-PCR分析这些转录因子在NaCl胁迫下的时空表达谱，筛选出一个关键调控基因LcSRA1（KC777345）。拟在此基础上，采用转录组学分析LcSRA1调控的下游靶基因，分离鉴定LcSRA1蛋白结合的顺式作用元件；比较蛋白质组学技术分离鉴定调控的靶蛋白；通过酵母双杂交技术分离鉴定LcSRA1互作蛋白；PCR技术克隆LcSRA1基因的启动子并分析其功能；应用酵母单杂交技术分离鉴定调控LcSRA1基因表达的反式作用因子，阐明LcSRA1作用的靶基因及其转录调控分子机制，系统地揭示LcSRA1转录因子在百脉根耐盐胁迫中的分子调控网络，为牧草抗逆分子改良与育种提供理论基础与技术支持。

土壤盐渍化对农牧业的威胁是全球性问题，严重影响了农牧作物的生长、发育及产量，面对逆境胁迫，植物有自身的抗逆机制，但是，植物的抗逆特性是由多基因控制的数量性状，目前，豆科牧草耐盐性分子机制的研究水平及分子生物学手段比较薄弱，与培育出具有农业生产价值的抗盐牧草品种还存在很大差距，因此，挖掘牧草抗盐关键基因，揭示其调控的抗逆分子机制，培育抗逆高产牧草品种的相关研究工作需亟待加强。.在逆境信号网络中，各种转录因子既可作为调控基因表达的分子开关，又可作为接受逆境信号的终点。其中AP2/ERF基因家族是重要的抗逆转录因子，本项目以优质豆科牧草百脉根“Leo”为材料，从全基因组中分离、鉴定出127个AP2/ERF家族成员，通过qPCR分析这些转录因子盐胁迫下的时空表达谱，筛选出了18个盐诱导表达基因，转化拟南芥进行抗逆功能分析，筛选出了一个关键调控基因LcSRA1。亚细胞定位和酵母单杂交实验结果证实LcSRA1是定位于细胞核的转录激活子；构建了LcSRA1过表达、RNAi干扰载体，遗传转化百脉根，获得了转基因百脉根株系，通过对其进行转录组测序分析差异表达基因，分离鉴定出了LcSRA1调控的下游靶基因有4个，分别是：Lj0g3v0242029（核糖体蛋白）、Lj0g3v0342769（脂肪氧合酶）、Lj1g3v3330050（几丁质酶）和Lj0g3v0070989（镁螯合酶）； 采用酵母双杂交和双分子荧光互补实验分离、鉴定出了LcSRA1与Med25蛋白互作。综上所述，在盐胁迫下，关键转录因子LcSRA1通过与Med25蛋白互作，结合下游靶基因Lj0g3v0242029、Lj0g3v0342769、Lj1g3v3330050和Lj0g3v0070989的启动子GCC-box顺式元件，转录激活抗逆相关基因表达，从而提高百脉根的耐盐性，揭示了LcSRA1转录因子在百脉根耐盐胁迫中的分子调控网络，为牧草抗逆分子改良与育种提供了理论基础与技术支持。