长柄扁桃醇腈酶纯化、鉴定及功能性质研究

Hydroxynitrile lyase (HNL) is an important biocatalyst for enantioselectively producing cyanohydrins in industrial technology. It’s the highlights in the area of asymmetric synthesis. In our previous investigation, we discovered a novel source of HNL that was purified from the seeds of a psammophyte plant, Amygdalus pedunculata Pall (A.P.). And the purified enzyme displayed a high specific activity over a wide range of pH values and temperatures. It maybe considered as a valuable catalyst in industrial biotechnology. The project will be to establish a purification strategy from A.P. (APHNL) by (NH4)2SO4 fractionation, chromatographic column and ultrafiltration salting. The assay methods of mass spectrum, N-terminal sequence, ultraviolet spectrum and so on will be used to characterizated the structure of the enzyme. Then the influence of substrate concentration，pH, temperature，activator and inhibitor on the enzyme activity and kinetic parameters will be measured by the technologies of physical chemistry and biochemistry. In addition, the localization of APHNL in the cell will be examined by using immunohistochemistry and western-blotting. Accordingly, the possible biological function of APHNL will be explained through the analysis of the changes of enzyme activities and expression levels in different developmental stages of A.P. seeds. The result will not only enrich the fundamental research of natural hydroxynitrile lyase, but also supply experimental data and theoretical basis for its application in the industrial production of cyanohydrin.

醇腈酶是工业合成氰醇反应的一种重要的生物催化剂，是不对称合成领域研究的热点。我们前期研究发现，沙生植物长柄扁桃种仁中存在一种醇腈酶，其活性具有较宽的pH和温度范围，有望被开发成一种优质的生物催化酶制剂。本项目将以长柄扁桃种仁为原料，利用盐析、柱层析及超滤等技术，建立一套长柄扁桃种仁醇腈酶的精纯工艺；采用质谱、N-端测序、紫外光谱等技术对其进行结构表征和鉴定；同时，利用物理化学和生物化学手段研究底物浓度、温度、pH、激活剂和抑制剂等条件对醇腈酶活性和酶促反应过程的影响，揭示酶促反应动力学规律；最后利用免疫组织化学、western-blotting等方法研究醇腈酶在种子细胞中的分布特点，通过对果实不同发育期酶活性及表达量的变化规律的分析，阐释其可能的生物学功能。研究成果不仅可以丰富天然醇腈酶相关领域的基础研究，也可为把长柄扁桃醇腈酶开发成一种氰醇工业生产用酶提供理论依据和数据支撑。

醇腈酶是一种用于催化氰醇不对称合成反应的重要生物酶。课题组前期研究表明，沙生植物长柄扁桃种仁中含有醇腈酶。本项目以长柄扁桃种仁为原料，通过优化盐析和色谱条件，建立了目标蛋白的分离纯化路线，纯化倍数达138，产率达4.2%，比酶活为661 U/mg，电泳纯度达95%，是分子量约为61 kDa的单体。通过MALDI-TOF-MS、MALDI-TOF-MS/MS和N端测序结合数据库检索对目标蛋白进行种属鉴定，纯化得到的蛋白为长柄扁桃醇腈酶。以扁桃腈为底物研究温度、pH对长柄扁桃醇腈酶酶活稳定性以及酶动力学的影响。长柄扁桃醇腈酶在70 ℃仍具有活性，在50 ℃以下、pH 6.0-12能稳定存在。金属离子Fe3+，Ba2+和Fe2+对酶活性几乎无影响，Mn4+，Mg2+，Cd2+，Al3+金属离子对酶活显示部分抑制，其他金属离子显示轻微的抑制，Ag+和Hg2+对长柄扁桃醇腈酶的活性有明显的抑制作用。酶动力学显示，Km 值为0.5 mM，Vmax 值为665.9 μmol mg-1 min-1，Kcat 值为676.5 s-1 ，Kcat/Km 值为1353 s-1 mM-1。长柄扁桃醇腈酶可以催化苯甲醛，间苯氧基苯甲醛和氢氰酸反应，产物（R）-扁桃腈和(R)-2-羟基-2-（3-苯氧基-苯基）-乙腈的摩尔转化率各为90%和98%，手性光学纯度分别为94%和93%。结果表明长柄扁桃醇腈酶具有催化选择性，是一种催化合成氰醇对映体的优良生物催化剂。制备了长柄扁桃醇腈酶的抗体，并采用western blot和免疫组织化学定位的方法研究了醇腈酶在长柄扁桃生长发育过程中的分布情况，发现醇腈酶主要分布在果实发育期的胚和胚乳，果实成核期的种皮表层细胞原生质体和子叶原生质体和原形成层，果实成熟期的种皮表层细胞原生质体和子叶原生质体和原形成层，并随果实成熟，呈现增长的趋势。研究结果不仅可以丰富长柄扁桃领域的基础研究，而且为天然醇腈酶的应用奠定理论基础。. 本项目共发表研究论文11篇。培养硕士生4人，博士生1人。