人脂肪源性血管外膜干细胞对造血干/祖细胞支持作用的研究

Mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow participate in the formation of hematopoietic microenvironment and play an important regulatory role on hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). However, their application is limited because of their very sparse and difficult to obtain in bone marrow. Our previous study demonstrated that MSC was derived from perivascular stem cell (PSC), and PSC was the precursor of MSC. PSCs are widely distributed, especially in adipose tissue, which are rich in content, easy to be harvested with minimal damage, and rapid cell proliferation. However, very few researches have been done on whether adult adipose derived PSCs (AD-PSCs) are involved in HSPCs expansion/proliferation, differentiation and possible hematopoietic regulation mechanisms. Based on the above research background and research ideas, in current study, we intend to establish an efficient method for the isolation and purification of human AD-PSCs. We will study on the regulation of proliferation and differentiation of HSPCs in vitro. Furthermore, whether in vivo co-transplantation with AD-PSCs can support long-term hematopoietic reconstitution is going to be investigated. The results of present study will help us to find a new the rich source of stromal cells to promote HSPCs, Which will lay the foundation for the clinical application of AD-PSCs to support hematopoietic reconstitution.

骨髓间充质干细胞（MSCs）参与造血微环境构成，对造血干/祖细胞(HSPCs)起重要的调控作用，但由于其在骨髓中数量稀少且不易获取，限制了其的应用。血管外膜干细胞（PSCs）是血管微环境重要核心组成成分，为HSPCs的生长及增殖有重要的支持作用。我们前期的研究显示，MSCs来源于PSCs，PSCs是MSCs的前体细胞。PSCs分布广泛尤其在脂肪组织中含量丰富，获取容易且损伤小，细胞增殖快等优点，但成人脂肪来源的PSCs（AD-PSCs）是否参与促进HSPCs的扩增、分化和可能的造血调控机制研究甚少。基于以上研究背景及研究设想，1.建立人AD-PSCs分离和纯化的有效方法；2.在体外条件下研究其对HSPCs增殖、分化的调控；3.研究联合AD-PSCs的体内共移植是否起到支持长期造血重建，为促进HSPCs的扩增提供一个崭新而丰富的基质细胞的来源，为AD-PSCs支持造血重建的临床应用奠定基础。

背景：间充质干细胞（MSCs）作为骨髓基质细胞的前体细胞，分泌多种造血相关因子，促进造血恢复和重建，但在人体骨髓中MSCs的含量少，应用受到限制。研究表明，MSCs起源于毛细血管和微血管壁上的血管外膜干细胞（PCs），然而作为MSCs前体细胞的PCs，是否有促进造血干/祖细胞（HSPCs）扩增和可能的造血调控机制有待于研究。利用多参数流式细胞术（MFC）分选、纯化出人脂肪源性CD146+PCs并进行鉴定，研究其是否支持人脐血CD34+细胞在体内外促进内造血重建，为HSPCs的扩增提供一个崭新而丰富的支持细胞的来源。.研究内容：1.利用MFC术分离、纯化人脂肪源性CD146+PCs，及体外培养及生物学特性的研究；2.建立以CD146+PCs为滋养层的脐血CD34+细胞体外培养体系，以了解CD146+PCs能否长期维持脐血CD34+细胞的扩增。实验组以CD146+PCs为基质细胞与免疫磁珠分选后的CD34+HSPCs共培养，阳性对照组以BM-MSCs为基质细胞与CD34+HSPCs共培养，空白组以CD34+HSPCs单独培养；于共培养后的第1周、2周和4周对CD34+HSPCs的细胞数量、集落形成、造血标记表达及上清中造血因子分泌进行分析。3.采用免疫磁珠法从CD146+PCs与脐血CD34+细胞共培养后的细胞中分选出CD45+细胞并植入经亚致死剂量照射后的NCG小鼠体内，观察造血重建。.重要结果：1.分选得到的人脂肪源性CD146+PCs，经回测细胞纯度可达（93.30±0.86）%，体外培养能够稳定传代。2.CD146+PCs贴壁生长，细胞形态呈纤维样，表达MSCs表面抗原CD44、CD73、CD90、CD105；且可分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞。3. 基质细胞与CD34+HSPCs共培养1周、2周及4周后，实验组和阳性对照组的细胞数量、集落形成能力及免疫表型（CD45+、CD34+CD33-、CD10+/CD19+、CD14+）均无统计学差异（P>0.05,n=5）。上清中细胞因子分泌结果显示：实验组在1周时SCF和2周时G-CSF表达量分别高于阳性对照组，实验组在2周时IL-2，在4周时SCF、G-CSF和VEGF表达量低于阳性对照组，差异具有统计学差异；实验组和阳性对照组的IL-3、IL-6、TPO、IFN-γ及TNF-α表达量各时间点无统计学差异。