万古霉素耐药肠球菌非信息素反应型接合性质粒水平转移机制

万古霉素耐药肠球菌（VRE）是医院感染重要的病原菌，在我国有逐年增多趋势。万古霉素耐药基因可在肠球菌间水平转移，加速耐药性的播散。本研究利用我国独特的菌种资源，研究万古霉素耐药肠球菌中耐药基因水平转移类型,建立我国肠球菌接合性质粒菌种库。对于已发现的非信息素反应型接合性质粒pZB18采用"霰弹法"结合PCR直接测序法进行全序列测定，通过人工及软件分析查找转移起始点（oriT）和释放酶基因编码区，并通过克隆及协同转移试验对oriT加以确认，采用重叠延伸法构建突变体对释放酶编码基因加以确认，此外，采用转座子插入诱变技术寻找其他影响转移的基因，明确耐万古霉素肠球菌中非信息素反应型接合性质粒水平转移机制。该研究对于明确我国万古霉素耐药肠球菌耐药基因的主要转移方式，尤其是非信息素反应型接合性质粒转移机制有重要意义，为进一步研究防止万古霉素耐药基因的播散措施提供依据。

万古霉素耐药肠球菌（VRE）是医院感染的重要病原菌，美国ICU血流感染患者屎肠球菌万古霉素耐药率已经超过80%，在我国有逐年增加的趋势。肠球菌携带万古霉素耐药基因可以水平传递给其他细菌，美国出现的万古霉素耐药金黄色葡萄球菌已经证实其万古霉素耐药基因主要来自于肠球菌。因此研究肠球菌基因传递机制，为今后遏制耐药基因播散具有重要意义。. 本研究通过收集我国VRE，对菌种及万古霉素耐药基因鉴定，明确我国VRE中以vanA型屎肠球菌为主，此外还有万古霉素耐药粪肠球菌、鹑鸡肠球菌、铅黄肠球菌和鸟肠球菌，耐药基因型在粪肠球菌和屎肠球菌中以vanA型为主，鹑鸡肠球菌、铅黄肠球菌中以vanC型为主。. vanA型万古霉素耐药屎肠球菌MLST分析显示，209株分离菌株被分为31个ST型，其中ST78、ST203和ST341占比例较高，分别为：39.1% ,13.0%和4.8%。ST78不分布广泛，在北京，天津，杭州，南京，青岛，大连等地区均有发现，大多属于CC17，为国际上万古霉素耐药屎肠球菌主要流行克隆群。 . 万古霉素耐药屎肠球菌vanA基因携带于Tn1546样转座子上，该转座子大多位于非信息素反应型接合性质粒上，可以在液体环境中肠球菌间水平传递。针对我国最早分离出的ZB18菌株中携带万古霉素耐药基因的质粒pZB18进行序列测定，该质粒全长68058bp，具有64个ORF，52个ORF与pMG1的ORF具有相似性，基因同源性为40%-90%。pZB18携带有与pMG1接合转移相关的 traA、 traB和 traD 基因，氨基酸同源性分别为44%, 57%和 80%。. pZB18接合相关oriT已经克隆证实。两种质粒可以在同一肠球菌中同时稳定存在，说明两种质粒具有相容性。pZB18型traA与pMG1型traA分布具有一定地区差异，pZB18型traA主要分布在浙江、江苏，而北京主要为pMG1型traA。